霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的急性肠道传染病。始于1961年、至今未停息的第七次霍乱大流行由霍乱弧菌的01群E1Tor型引起。我国使用噬菌体-生物分型方案对El Tor型菌株进行分型,并将E1Tor型菌株区分为流行株和非流行株两类,长期观察发现流行株出现于霍乱流行期间、以及主要分离自病人,非流行株不感染人或偶引起腹泻。从毒力基因上,流行株几乎均为产毒株、非流行株均为非产毒株。霍乱弧菌烈性噬菌体VP2和VP4属于噬菌体-生物分型方案中五个分型噬菌体中的两个。了解分型噬菌体感染霍乱弧菌的机制,能够明确已应用多年的霍乱弧菌噬菌体-生物分型方案的机理,并且通过分析敏感菌株和抗性菌株之间与噬菌体感染相关的基因差异,对于了解El Tor型霍乱弧菌的遗传多样性和适应性进化均有重要的意义。噬菌体感染细菌的第一步是受体识别,本研究以分型噬菌体的识别受体为研究目标,探索噬菌体敏感株和抗性株的受体差异。首先对分型噬菌体VP4进行了全基因组测序。VP4为短尾噬菌体,基因组为线性双链DNA,长31693bp,G+C含量为46.8%。预测存在45个编码基因,其中包括3个能预测到已知功能的基因。对噬菌体颗粒进行了蛋白质组的质谱鉴定,有26个蛋白与预测的基因相对应,验证了这些基因预测的正确性,另外也展示了VP4颗粒中的噬菌体蛋白组成。本研究中通过建立野生型VP4敏感株N16961的转座子插入突变库,筛选到了9株VP4抗性突变株。在这些抗性株中,转座子分别插入在manB、manC、 gmd、wbeN、wbeG、wbeU和recJ基因阅读框内部。manB、manC、gmd、wbeN、wbeG和wbeU属于wbe基因簇,与霍乱弧菌O-抗原的合成相关。分别构建manC、 wbeN、manB、wbeG、wbeU以及recJ的表达质粒,分别回补到转座子突变了相应基因的突变株中,这些抗性株均回复为敏感株,提示了这些基因失活与产生VP4抗性有关；通过同源重组、自敏感株N16961构建了manB、wbeN、wbeU和w6eG的基因缺失株,显示这些缺失株对VP4感染产生了抗性,而把这些基因相应回补到各缺失株中,均重新获得了VP4感染的敏感性,证实了这些基因与VP4感染直接有关。我们选取了manB和wbeU缺失株,分析了其O-抗原的完整性,发现缺失株中O-抗原缺失、VP4不再吸附和感染裂解,回补相应基因后O-抗原完整、重新获得VP4的吸附和感染,证明了O-抗原是VP4的受体。recJ基因缺失后产生对VP4的抗性,回补后恢复敏感性,但是吸附实验证明其与VP4的吸附无关,鉴于RecJ在其他细菌中发现的功能,我们推测其与VP4进入宿主后的基因组复制相关。为分析自然分离的VP4抗性菌株中O-抗原基因合成簇在其VP4抗性中的可能作用,我们对5株VP4天然抗性株wbe基因簇进行了测序,发现部分基因出现了导致氨基酸残基改变的突变以及静息突变,通过分别回补相应突变基因,证明这些自然抗性菌株中manB、wbeE和wbeU基因上的突变引起VP4感染的抗性,而在wbeU和manC基因上的突变没有引起VP4的抗性。我们还发现有三株菌株在回补其突变基因后、仍没有恢复VP4感染的敏感性,提示这些菌株可能还有其他VP4感染抗性机制。我们利用构建的转座子突变库,还筛选了分型噬菌体VP2的抗性突变株。共得到5株VP2抗性株,测序发现转座子插入在VC1384、VC0760和VC0761基因内部。进一步利用同源重组自野生株N16961构建了基因VC1384和VC0760的缺失株,发现VC0760基因缺失后只存在部分VP2抗性,VC1384缺失后产生了VP2抗性。白VC1384基因缺失株回补该基因后,恢复了VP2敏感性,但是吸附实验显示VP2仍吸附于突变株。序列比对显示VC1384编码蛋白属于OMP_b-br1家族成员,该家族中为跨膜蛋白,含有较多的p折叠,可形成孔道,因此推测VV1384基因产物可能与VP2的DNA注入有关。鉴于目前获得的VC0760缺失株表型,提示还需要关注其上下游基因的功能。在本研究中,我们通过鉴定到0-抗原为烈性噬菌体VP4的受体,分析了自然分离的霍乱弧菌VP4感染敏感菌株和抗性菌株的O-抗原合成基因簇的差异,利用该策略,我们能够明确霍乱弧菌菌株的噬菌体敏感与抗性机制,并且明确不同菌株中的关联到功能差异的基因组变异。自然水体中存在的霍乱弧菌噬菌体,能够感染和杀灭针对该噬菌体敏感的菌株克隆,而对此噬菌体抗性的菌株得以在自然界中生存下来,并可能导致流行。因此,我们鉴定到的这些针对VP4的抗性株,至少在存在VP4及其相似噬菌体的环境中,具有一定的生存优势。