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实验背景与目的:细胞焦亡作为一种不同于细胞凋亡的细胞炎性死亡模式,其最终执行蛋白为GSDM家族成员,其中GSDME蛋白作为GSDM家族的一员,其N端结构域的活化表达可诱导细胞焦亡的发生,有研究提出部分肿瘤细胞接受化疗药物治疗后可以激活Caspase3酶剪切GSDME断裂释放其N-GSDME末端活性片段诱导细胞焦亡,从而促进肿瘤细胞死亡。本课题探索通过构建N-GSDME-p GV141重组表达质粒,将N-GSDME基因在肝癌细胞中过表达,研究通过在肝癌细胞中直接表达活性N-GSDME分子,观察其对肝癌细胞焦亡的影响和相关分子的变化,为肿瘤靶向治疗提供新的思路。实验方法:1.生物信息学分析肝癌相关GSDME m RNA与蛋白表达水平及q RT-PCR与Western-Blot验证（1）采用UALCAN网站在线分析TCGA中肝癌与正常组织的GSDME表达差异。（2）使用CCLE数据库观测分析GSDME m RNA在各肿瘤细胞系中的表达分布,进一步统计分析肝癌细胞系中的GSDME m RNA表达差异。（3）基于Dep Map数据库观测分析GSDME蛋白在各肿瘤细胞系中的表达分布,进一步统计分析肝癌细胞系中的GSDME、Caspase3蛋白表达差异。（4）q RT-PCR实验验证肝癌细胞系中GSDME m RNA实际表达水平。（5）Western-Blot实验验证肝癌细胞系中的GSDME与Caspase3的实际蛋白表达水平。2.N-GSDME表达对肝癌细胞焦亡的影响（1）酶切验证N-GSDME-p GV141重组质粒,通过将空载p GV141质粒与N-GSDME-p GV141重组质粒进行扩增提取,使用单酶切与双酶切验证质粒中有无目的基因的插入。（2）显微镜下观察N-GSDME-p GV141质粒转染肝癌细胞后,细胞形态学变化。（3）q RT-PCR与Western Blot实验检测质粒转染肝癌细胞后的N-GSDME分子表达水平。（4）Western Blot实验检测N-GSDME-p GV141质粒转染后Caspase3相关蛋白的表达变化。3.对质粒进行DNA测序分析其对细胞焦亡的影响（1）在观测到空载质粒转染肝癌细胞后出现与重组质粒相同的焦亡细胞表型后,将p GV141空载质粒及人源鼠源重组N-GSDME-p GV141质粒进行全长测序。（2）采用Snap Gene合成质粒结构并比对空载质粒与重组质粒,验证目的基因序列的插入。（3）NCBI在线Blast验证N-GSDME-p GV141质粒中目的基因与GSDME的匹配关系。（4）NCBI在线Blast排除p GV141空载质粒与N-GSDME、GSDME以及Caspase3的同源性。4.质粒转染细胞不同时间及细胞培养上清液对肝癌细胞焦亡的影响（1）显微镜下观察转染N-GSDME-p GV141质粒后每4 h间隔的肝癌细胞形态学变化。（2）Western Blot检测GSDME相关焦亡蛋白随时间的表达水平变化。（3）收集质粒转染后细胞培养上清液,与未经质粒处理的肝癌细胞共培养,观察24 h后细胞形态学变化以及Western Blot检测GSDME及Caspase3蛋白表达变化。结果:1.生物信息学分析及分子实验验证显示GSDME的表达水平在肝癌与正常组织以及不同来源的肝癌细胞中存在差异（1）UALCAN中分析TCGA数据库,其中肝癌组织中GSDME表达水平显著高于正常组织。（2）CCLE数据库中,40种人肿瘤细胞系中肝癌的GSDME m RNA表达排在第12位;而在25种人肝癌实验细胞系中,SK-Hep-1细胞的GSDME m RNA表达排在第4位高于排在第16位的Huh7细胞,GSDME甲基化水平为Huh7高于SK-Hep-1;不同肿瘤细胞系的GSDME m RNA表达水平不一。（3）Dep Map数据库中,SK-Hep-1的GSDME与Caspase3的蛋白表达均高于Huh7,与其GSDME DNA甲基化趋势表现为负相关。（4）我们通过q PCR与WB实验验证发现人肝癌细胞系的GSDME的转录与翻译水平都高于鼠肝癌细胞系,鼠肝癌细胞系中Caspase3的蛋白表达水平则高于人肝癌细胞;且SK-Hep-1与Huh7的分子表达水平高低差异与生物信息学数据库趋势相反。2.p GV141空载质粒与N-GSDME-p GV141质粒均可导致肝癌细胞焦亡（1）我们通过酶切验证N-GSDME-p GV141组成正确。（2）显微镜观察结果显示p GV141与N-GSDME-p GV141质粒转染后,肝癌细胞SK-Hep-1、Hun7与Hepa1-6在24 h时已出现气球样变表型,而鼠的Hepa1-6α细胞出现同样的形态学变化却滞后至48 h。（3）q PCR结果显示,N-GSDME-p GV141质粒转染后,肝癌细胞中N-GSDME m RNA过表达（P＜0.0001）,而细胞内GSDME全长的m RNA水平无明显变化（P＞0.05）。同种属两肝癌细胞系之间,N-GSDME过表达倍数无显著差异。（4）WB实验结果显示,SK-Hep-1细胞的p GV141空载质粒组与N-GSDME-p GV141质粒组均出现N-GSDME蛋白表达,未见Cleaved-Caspase3蛋白表达;Hepa1-6中的p GV141空载质粒组与N-GSDME-p GV141质粒组均出现Cleaved-Caspase3的表达,未见N-GSDME的表达。3.全长测序比对分析结果显示p GV141空载质粒无GSDME相关基因插入（1）由于p GV141质粒转染肝癌细胞后与N-GSDME-p GV141质粒导致类似的表型与蛋白表达,但空载质粒转染组m RNA水平没有N-GSDME的过表达,于是我们将质粒送去全长测序,比对后确认两重组N-GSDME-p GV141中在KpnⅠ与XhoⅠ之间正确插入N-GSDME序列,而空载质粒无N-GSDME序列插入。（2）两重组质粒中N-GSDME序列分别与人,鼠GSDME m RNA转录本近N端100%匹配。（3）空载质粒全长序列中不包含N-GSDME,GSDME与Caspase3同源序列。4.N-GSDME-p GV141质粒对肝癌细胞作用随时间进展逐渐显现（1）重组质粒转染后,人肝癌细胞系SK-Hep-1在4-12 h之间气球样变范围增加,在4-8 h之间出现N-GSDME的蛋白表达。（2）重组质粒转染后,鼠肝癌细胞系Hepa1-6在4-12 h之间气球样变范围增加,但GSDME相关蛋白及Cleaved-Caspase3在12h内未见明显表达。5.质粒转染后的细胞培养上清后可引起肝癌细胞气球样变（1）使用转染质粒后的SK-Hep-1和Hepa1-6肝癌细胞培养上清液对未经质粒转染的肝癌细胞再次培养后,细胞均出现少量气球样变表型。（2）SK-Hep-1细胞经用N-GSDME-p GV141质粒诱导肝癌细胞焦亡后的细胞培养上清进行处理,WB实验中检测出现N-GSDME的蛋白表达。Hepa1-6细胞同样处理后却未检测出N-GSDME与Cleaved-Caspase3的表达。结论:通过对生物信息学数据库的挖掘,我们发现GSDME在肝癌中的表达水平明显高于正常组织,且相较于人肝癌,鼠肝癌中的GSDME表达水平更低,说明肝癌适宜进行GSDME相关焦亡的研究。在细胞水平上,N-GSDME-p GV141可以导致肝癌细胞出现焦亡表型;在分子水平上,N-GSDME-p GV141转染使肝癌细胞中的N-GSDME m RNA表达增加,但在翻译水平上N-GSDME-p GV141组与空载p GV141组均可表达N-GSDME。通过质粒测序及Blast比对我们排除了空载质粒序列本身的干扰;进一步研究N-GSDME-p GV141质粒整体对肝癌细胞焦亡的影响,我们发现该重组质粒诱导Hepa1-6肝癌细胞的气球样变及SK-Hep-1肝癌细胞的焦亡表现在12h内逐渐明显。通过上清置换共培养实验,我们发现在该重组质粒诱导SK-Hep-1细胞焦亡后可能释放细胞因子诱导级联放大效应的出现。