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本论文的研究工作是本课题组承担国家自然科学基金项目的主要研究内容之一。通过正交试验设计优化了灰树花菌丝体蛋白提取的工艺;在灰树液体发酵体系中加入天麻醇提液,研究天麻有效成分与灰树花发酵间的相互作用,阐明天麻有效成分影响灰树花菌丝体生长和灰树花胞外蛋白合成机理及它们间的相互作用情况;研究天麻醇提物对灰树花菌丝体蛋白抗氧化活性的影响;通过运用双向凝胶电泳对灰树花菌丝体差异蛋白进行分离,质谱技术及生物信息学分析鉴定差异蛋白,用成功鉴定的差异蛋白在蛋白质组学水平上解释可能造成发酵过程中各种生理生化指标明显变化的原因。为了获得提取率高的灰树花菌丝体蛋白,以灰树花菌丝体为原料,采用超声波提取灰树花菌丝体蛋白。在单因素试验基础上,采用正交试验设计,以蛋白提取率为评价指标,对提取工艺条件进行优化。结果表明,最佳提取条件为液料比95∶1(mL∶g),超声功率600 W,超声温度35℃,超声时间3 min,pH 10.5,在该条件下,灰树花菌丝体蛋白提取率为(5.10±0.04)%。在灰树花深层发酵体系中加入天麻醇提物,以灰树花生物量和胞外蛋白合成量为指标,对天麻醇提物的最优添加量进行优选;利用高效液相(HPLC)对天麻醇提物成分进行分析,研究天麻醇提物灭菌前后主要成分(天麻素、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲醇及巴利森甙)含量的变化,并研究其促进灰树花生物量和菌丝体胞外蛋白合成的关键成分在灰树花发酵体系中的含量变化。结果发现,7%(体积分数)天麻醇提物可以促进灰树花菌丝体生长和胞外蛋白的合成,生物量和胞外蛋白合成量在发酵第11天时达到最大值;在天麻醇提物灭菌后,巴利森甙含量明显减少,天麻素含量明显增加;天麻醇提物加入灰树花发酵体系14d后,天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛含量均降低,但巴利森甙含量增加了161.11%。研究天麻醇提物对灰树花菌丝体蛋白抗氧化活性的影响。实验组(加入7%(v/v)天麻醇提物至灰树花发酵体系中)与对照组(未加入培养天麻醇提物至灰树花发酵体系中)培养11d后,灰树花菌丝体粗蛋白含量分别26.76±0.56g/100g和27.52±0.76g/100g,即实验组菌丝体单位质量内含的粗蛋白略低于对照组。实验组与对照组的抗氧化能力(DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力及还原力)均低于Vc组;实验组与对照组(浓度为1.0 mg/m L)均有一定的DPPH自由基清除能力且实验组比对照组高15.51%(p<0.05);实验组与对照组(浓度为0.8 mg/m L)均有一定的羟基自由基清除能力且实验组比对照组高23.96%(p<0.05);实验组与对照组(浓度为0.8 mg/mL)均有一定的还原力且实验组比对照组高12.50%(p<0.05);这表明天麻醇提物可以促进灰树花菌丝体蛋白的抗氧化能力增强。基于双向凝胶电泳及质谱分析对天麻醇提物刺激灰树花深层发酵菌丝体差异性蛋白的筛选及鉴定。分别将处理和对照的双向电泳图片进行比较,进行差异蛋白筛选,对三次重复的实验数据进行T检验,p值小于0.05的蛋白点则属于差异显著,差异蛋白筛选的标准:倍数变化大于2或小于0.5认为是差异蛋白。各差异比较组筛选到的差异表达蛋白数目:实验组与对照组相比,有68个差异蛋白,其中表达上调的蛋白28个,表达下调的蛋白40个。选取有代表性的18个差异点进行MALDI-TOF/TOF,将获得的PMF数据和肽序列数据通过Mascot在NCBInr数据库中搜索,与数据库中已知蛋白质肽段质量数据进行比对,成功鉴定的差异蛋白点13个,其中表达上调的差异蛋白点9个(成功鉴定为8种蛋白质),表达下调的差异蛋白点4个(成功鉴定为4种蛋白质)。表达上调的蛋白质有肌球蛋白调节性轻链cdc4、葡萄糖调节蛋白、ATP合酶δ亚基、细胞色素b5、热休克蛋白HSS1、热休克蛋白、A0H81-11392蛋白及过氧化物还原酶;表达下调的蛋白质有精氨酸酶、磷酸变位酶蛋白3、乙醛脱氢酶及烯醇化酶。