人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus,hRSV）是婴幼儿和老年人发生严重呼吸道疾病的主要病因之一,据统计全球每年因hRSV感染产生的经济负担超过800亿美元。自上世纪50年代hRSV被发现以来,国内外科研人员对hRSV疫苗进行了大量的实验探索,至今仍然没有被批准上市的hRSV疫苗。与其他呼吸道病毒相比,hRSV自然感染不能产生持久免疫力,容易反复感染同一亚型的hRSV。hRSV疫苗一直面临安全性不足或免疫原性弱的巨大挑战,目前已有7种进入临床试验阶段的hRSV疫苗宣布失败,包括灭活疫苗,亚单位疫苗和载体疫苗等。因此急需开发一种安全有效的hRSV疫苗来预防hRSV感染。hRSV的融合蛋白（F）高度保守,诱导产生的抗体可同时抑制A、B亚型hRSV的感染。2013年,研究者解析出F蛋白的融合前构象（Pre-F）,并发现了 Pre-F特有的中和抗体表位（?）。表位（?）诱导产生的抗体中和活性高于其它表位。Pre-F蛋白已经在昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统中表达,但尚未有在酵母中表达的研究报道。本研究首次应用毕赤酵母GS115表达纯化了 Pre-F蛋白（RGF）,应用大肠杆菌BL21表达纯化的Pre-F蛋白（RBF）,并制备了一株鼠源性单克隆抗体,通过肌肉注射免疫在小鼠体内比较RGF蛋白和RBF蛋白的免疫原性。同时探索了原核表达的融合蛋白CTA1-DD-RBF滴鼻免疫后在小鼠体内的保护效果,结果如下:大肠杆菌遗传背景清楚,并且具有繁殖快和生产成本低等优势,应用pET32a质粒在大肠杆菌BL21中表达纯化了处于融合前构象的RBF蛋白和处于融合后构象的Post-RBF蛋白,RBF包含F蛋白26～513位点氨基酸,柔性蛋白linker（GSGSG）代替第105～146位点的氨基酸,在C端加入来源于T4噬菌体的β折叠构象（Foldon序列）。为使RBF蛋白处于融合前构象,并保证构象位点（?）稳定,在RBF蛋白上增加两对二硫键（S155C和S290C,A149C和Y458C）,替换两个疏水性氨基酸（S190F,V207C）。pET32a质粒可以实现硫氧还蛋白（Trx）与RBF蛋白的融合表达,凝血酶切割去除Trx和His标签后RBF蛋白以三聚体的形式存在。RBF蛋白免疫小鼠制备鼠源单抗,筛选的杂交瘤细胞分泌的抗体亚类为IgG2b和IgM,轻链为κ链。F蛋白的结构复杂,糖基化位点较多,在酵母中成功表达的难度大。本研究应用pPIC9K质粒在毕赤酵母GS115中成功表达了 F蛋白（RGF）,经过密码子优化和最佳表达条件的摸索后RGF蛋白表达量约为1.5 mg/L。RGF和RBF均以三聚体结构存在,RGF与5C4抗体的亲和常数为1.86×10-10,RBF与5C4抗体的亲和常数为1.26×10-9,Post-RBF蛋白与5C4抗体的亲和常数为1.27×10-7。RGF和RBF蛋白肌肉注射免疫BALB/c小鼠,均能诱导小鼠产生高滴度的中和抗体,并且可以显著降低肺脏病毒滴度,减少肺脏的病理损伤。与福尔马林灭活疫苗（FI-RSV）相比,RGF和RBF蛋白诱导产生偏向Th1类的细胞和体液免疫应答（P<0.001）。大量研究表明hRSV感染后没有针对IgA抗体的记忆B细胞产生,但当鼻腔IgA抗体滴度低时容易反复感染hRSV。因此通过滴鼻免疫诱导IgA抗体产生可以提高疫苗保护效果。粘膜佐剂CTA1-DD包含霍乱毒素的CTA1亚基和葡萄球菌蛋白A的两个免疫球蛋白结合域（DD）,滴鼻免疫毒性低,可以增强细胞和体液免疫应答。该佐剂已在埃博拉病毒、流感病毒、HIV疫苗的研发中应用。本研究中应用大肠杆菌BL21表达纯化了融合蛋白CTA1-DD-RBF,滴鼻免疫可以诱导BALB/c小鼠产生特异性体液免疫应答（IgG1、IgG2a、IgA及中和抗体）和细胞免疫应答。与FI-RSV相比,免疫CTA1-DD-RBF诱导Th1类的免疫应答,引起很小的肺脏病理损伤。此外,与RBF蛋白免疫组相比,CTA1-DD-RBF可以显著增强小鼠IgA抗体和血清中和抗体滴度,显著降低肺脏病毒滴度。综上所述,本研究首次比较了 RGF和RBF的免疫原性,并阐明了两种蛋白的优劣,为研发基于Pre-F蛋白的hRSV疫苗奠定了基础。探索了融合蛋白CTA1-DD-RBF滴鼻免疫小鼠后的保护效果,证实了 CTA1-DD-RBF蛋白是一种很有开发前景的粘膜疫苗,为hRSV疫苗的研发提供了新的方向和思路。