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研究目的:隐球菌性脑膜炎是一种中枢神经系统感染性疾病,其发病凶险,治疗困难,死亡率高。该病在国外主要发生在免疫功能低下的患者如HIV感染患者,但在国内,新生隐球菌感染的患者多为没有基础疾病的或无免疫抑制的人群中。细胞自噬是普遍存在于真核细胞中,参与正常细胞生长发育和生理病理过程的生命征象。自噬参与机体的很多病理过程,比如杀灭病原菌,调节免疫甚至杀灭肿瘤细胞。自噬在新生隐球菌感染巨噬细胞时所发挥的作用及其可能诱发的免疫应答情况目前尚无具体报道。故实验旨在通过新生隐球菌诱导小鼠单核巨噬细胞细胞系RAW264.7细胞,来观察自噬在新生隐球菌诱导巨噬细胞时发生的变化,并通过检测相关炎性因子TNF-α、IL-6的表达量,来探究自噬在新生隐球菌诱导RAW264.7细胞中产生及其可能的作用途经,为探讨自噬在新生隐球菌所致中枢神经系统感染中所发挥的作用及可能机制提供一定的参考。研究方法:第一部分,新生隐球菌最佳干预浓度检测及验证自噬体的表达。体外培养小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7,将灭活的新生隐球菌WM148与RAW264.7细胞按照细胞数1:1、2:1、4:1、8:1培养,设立0h、3h、6h、9h、12h时间点,用CCK-8试剂盒检测RAW264.7细胞的活性。筛选出最适宜浓度后,将细胞进行爬片后进行免疫荧光染色,荧光显微镜下观察自噬的存在。第二部分,新生隐球菌诱导自噬的表达规律,将培养的RAW264.7细胞按照细胞数与隐球菌数1:4的比例共培养,在0h、1h、3h、5h、7h时间点来收集细胞,用细胞流式方法检测各时间点的细胞凋亡,然后提取蛋白及RNA,通过Western blot及qRT-PCR方法分别检测自噬体在各时间点的表达情况。利用自噬体抑制剂(3-MA)抑制自噬后,观察细胞前后凋亡趋势变化。第三部分,自噬的表达及相关炎症因子变化情况。体外培养的鼠单核巨噬细胞系Raw264.7细胞,与新生隐球菌1:4干预,将0h、1h、3h、5h、7h时间点上清液和细胞分别收集到离心管中。采用ELISA方法检测各组上清液中TNF-α、IL-6随着时间的变化,表达水平的变化,加入自噬抑制剂3-MA后,再次检测各时间点TFN-α及IL-6的表达情况。结果:第一部分,不同浓度新生隐球菌干预巨噬细胞后,巨噬细胞的凋亡率均有度的升高,并且浓度越高、干预的时间越长,细胞凋亡率越高。因此,结合试验所需并查阅相关文献后,采用细胞与隐球菌按照1:4数量比来干预。通过免疫荧光显色方法可直接观察到自噬的产生。第二部分,新生隐球菌诱导后,细胞中自噬体的表达对比对照组(0h)明显升高(P<0.05),且随着干预时间延长,自噬的表达量逐渐升高。1h、3h、5h、7h组较对照组(0h)组逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05),自噬抑制后较抑制前,细胞的增殖减少,表明自噬对维持细胞稳定发挥重要作用。第三部分,新生隐球菌诱导RAW264.7细胞后,各组细胞上清液中TFN-α、IL-6的表达较对照组0h组增加,差异有统计学意义(P<0.05),抑制自噬后,各组细胞上清液中的TFN-α、IL-6的表达量较0h组增加但较未抑制时降低,差异有统计学意义(P<0.05)结论:新生隐球菌的干预可以对巨噬细胞的凋亡产生影响,且干预的浓度与凋亡率呈正相关。新生隐球菌诱导RAW264.7细胞炎性反应后,自噬体会随之表达,自噬表达水平随干预时间延长而逐渐增加,炎性因子TNF-α、IL-6的分泌也随着自噬体的增加或抑制而呈现不同的趋势。表明自噬参与并调控新生隐球菌诱导RAW264.7的炎性反应过程,其详细的作用机制需要进一步深入研究。