目的:乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的全球性公共卫生问题。据世界卫生组织报道,全世界约有3.5亿人患有慢性HBV感染,慢性HBV感染是肝细胞癌(HCC)发生的主要原因。一般情况下,慢性HBV感染者和无症状HBV携带者极少发生HBV再激活现象,但患者若接受化疗或免疫抑制治疗肿瘤时,则很可能使肝细胞内静息状态或是低复制状态的HBV大量活化,HBV病毒的大量复制引起肝功能损伤,甚至导致急性肝炎、急性重症肝炎、急性肝衰竭等严重的临床问题。临床上大量数据表明,在化疗药物的使用过程中出现HBV再激活现象,但是化疗药物诱导HBV再激活的具体分子机制至今仍不清楚,因此需要进一步研究。细胞自噬(autophagy)是通过依赖溶酶体去除受损细胞器和长寿命蛋白质一种分解代谢过程,以维持细胞稳态。自噬在许多生理和病理生理过程中起着至关重要的作用。自噬在病毒复制的过程中发挥着“双刃剑”的作用,一方面,自噬可以响应细胞压力,如营养物质剥夺,未折叠的蛋白质反应(UPR),危险相关分子模式(DAMP),缺氧,氧化还原应激和线粒体损伤。病毒可以在复制周期的不同阶段触发许多这些刺激诱导自噬,自噬可能作为抗病毒途径发挥作用。另一方面,自噬在病毒复制生命周期中发挥的有益作用,病毒可以逃避抗病毒先天免疫,从而增强其复制。研究表明,病毒感染可能与自噬过程有着复杂的相互联系,主要有以下三个主要结果:(1)自噬被用作促进病毒复制的支架;(2)病毒破坏或抑制自噬过程以促进病毒复制;(3)自噬抑制病毒复制。顺铂是一种有效的化疗药物,常用于治疗各种类型的癌症,包括淋巴瘤,肉瘤,卵巢癌,宫颈癌,小细胞肺癌和膀胱癌等。已有临床报道HBV再激活是使用顺铂等化疗药物严重的并发症之一。病毒复制后宿主免疫功能受损被认为是导致化疗相关HBV再激活的首要因素,但是研究报道HBV再激活发生在化疗早期,表明除了扰乱免疫和病毒复制之间的平衡机制,化疗药物可能直接刺激HBV再激活。因此,化疗药物或免疫抑制剂相关的HBV再激活的潜在的机制需要进一步研究,将为HBV再激活的预防和治疗提供新思路和理论依据。课题组前期实验中,已经在HBV稳定表达的细胞模型和HBV转基因小鼠模型中证实了顺铂可以促进HBV复制和HBV病毒蛋白的合成,因此本实验主要研究顺铂诱导HBV再激活的具体分子机制。实验方法:1、在HepAD38和HepG2-HBV1.3细胞中,采用ELISA、RealTime PCR、Southern blot、Western blot方法检测顺铂作用后HBV病毒复制水平。2、在HepAD38和HepG2-HBV1.3细胞中,采用Western blot、激光共聚焦的方法检测自噬蛋白和HBV病毒蛋白的表达水平,进一步联合使用自噬抑制剂氯喹(Chloroquine diphosphate salt,CQ)、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)和siATG5阻断自噬后检测HBV复制水平,分析顺铂、自噬和HBV复制的关系。3、采用激光共聚焦显微镜检测顺铂处理细胞后细胞内ROS水平,进一步顺铂联合氧化应激抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC),采用ELISA、Real-Time PCR、Southern blot、Western blot等实验,检测自噬水平和HBV病毒复制水平。4、运用Western blot实验及查阅文献,筛选了MAPKs通路相关的信号分子,联合使用shJNK、NAC、SC79和MK2206探索顺铂促进HBV复制的具体分子机制。5、HBV转基因小鼠模型实验验证顺铂促进HBV复制。腹腔注射氯喹或者饮水喂N-乙酰半胱氨酸处理小鼠两天,再联合顺铂连续注射五天,48小时后收集血清和肝组织采用ELISA、Real-Time PCR、激光共聚焦显微镜、Western blot、Southern blot以及IHC等实验方法检测。结果:1、顺铂处理HepAD38和HepG2-HBV1.3细胞后,实验结果显示,与对照组相比,Cisplatin组细胞上清中HBsAg和HBeAg水平、3.5kb mRNA水平、HBV DNA水平、HBV复制中间体以及细胞内HBsAg和HBcAg蛋白含量均明显升高。说明顺铂在体外促进HBV复制。2、采用Western blot和激光共聚焦检测顺铂作用后自噬水平变化,Western blot结果显示:与对照组相比,顺铂作用后LC3I/II蛋白水平呈浓度依赖方式增加,p62呈时间依赖方式降低;激光共聚焦实验显示:与对照组相比,RFP-LC3 puncta和GFP-LC3 puncta均明显增加,但是RFP-LC3 puncta较GFP-LC3 puncta增加更加明显。说明顺铂在体外可以促进完整自噬。采用顺铂进一步联合使用自噬抑制剂CQ、3-MA和siATG5抑制自噬后,Western blot结果显示:自噬水平降低和HBV复制水平均降低。3、顺铂处理HepAD38和HepG2-HBV1.3细胞后,采用激光共聚焦显微镜检测ROS水平,结果显示顺铂明显增强了细胞内ROS水平。进一步采用氧化应激抑制剂NAC,Western blot结果显示:与Cisplatin组相比,Cisplatin+NAC组发现LC3、HBsAg和HBcAg蛋白水平降低;ELISA结果显示,与Cisplatin组相比,Cisplatin+NAC组细胞上清中HBsAg和HBeAg水平降低;Real-Time PCR结果显示:与Cisplatin组相比,Cisplatin+NAC组3.5kb mRNA和HBV DNA水平降低;Southern blot结果显示:与Cisplatin组相比,Cisplatin+NAC组HBV复制中间体水平降低。以上结果说明顺铂通过ROS诱导自噬,抑制ROS会降低顺铂诱导HBV再激活的作用。4、采用Western blot方法筛选了MAPKs通路相关的信号分子,结果显示:Cisplatin作用后,p-JNK表达增加,p-mTOR和p-AKT表达降低,p-p38无明显变化。采用NAC与Cisplatin联合处理,与Cisplatin组相比,p-JNK蛋白水平表达降低,p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR无明显变化。进一步使用shJNK或SC79(AKT诱导剂)与Cisplatin联合处理均可部分逆转Cisplatin诱导的自噬和HBV复制水平,而ROS水平无变化;使用MK2206(AKT抑制剂)与Cisplatin联合处理可促进Cisplatin诱导的自噬蛋白和HBV病毒蛋白,而ROS水平无变化。以上结果说明说明顺铂通过ROS上调JNK和抑制AKT/mTOR信号激活自噬并诱导HBV再激活。5、在HBV转基因小鼠模型中,顺铂促进HBV复制、HBV病毒蛋白合成和诱导炎症,同时顺铂促进ROS水平、MDA水平和自噬水平增加。用ROS抑制剂NAC或自噬抑制剂CQ预处理可以逆转顺铂诱导自噬增强HBV复制,而CQ不影响顺铂诱导的ROS水平增加。结论:在本课题中,我们在HBV复制细胞模型和HBV小鼠模型中证实顺铂促进HBV再激活,从分子水平解析了顺铂通过ROS上调JNK/p-38、抑制AKT/mTOR信号诱导自噬促进HBV复制,为探索HBV再激活的分子机制提供了新的思路。