火龙果的溃疡病菌分离鉴定与火龙果抗溃疡病的生理与分子基础研究

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火龙果溃疡病是其生产中危害最大的病害,严重影响其产量和品质,造成极大的经济损失,是制约其产业发展的最主要病害。对火龙果溃疡病展开深入研究,具有重要的实践意义和理论价值。本研究从两个方面展开研究,一方面从病原菌入手,分离鉴定火龙果溃疡病的致病菌,并筛选其化学及生物防治药剂;另一方面从火龙果入手,采用扫描电镜、代谢组学结合转录组学、生物信息学和分子生物学等技术方法,研究火龙果抗溃疡病的生理生化及分子机制,挖掘重要的抗病相关基因,并对重要基因进行深入鉴定和功能研究。主要研究结果如下:1.引起火龙果溃疡病的病原菌为新暗色柱节孢菌Neoscytalidium dimidiatum。通过分离纯化及分子鉴定表明,引起火龙果溃疡病的是新暗色柱节孢属Neoscytalidium dimidiatum真菌。该菌菌丝细长呈发射状,生长迅速,菌落初期白色,之后变灰色,后期则呈黑色,表面有白色的分生孢子团产生。显微镜下,真菌分生孢子呈杆状,菌丝呈分枝状、无隔;节孢子,呈椭圆形,串联成链状;厚垣孢子壁厚,椭圆形。火龙果嫩枝条及果实容易感病,在田间感病初期出现褪绿小白点,之后病斑逐渐变大呈铁锈色,在感病的后期阶段,病斑逐渐扩展变成黑色并腐烂。2.针对火龙果溃疡病菌,在室内进行了化学及生物防治药剂的筛选。结果表明,化学杀菌剂对溃疡病菌均有一定的抑制作用,异菌脲、咪鲜胺锰盐、丙环唑、氟硅唑抑菌效果较好。油茶饼、菜籽饼、花生饼三种生物残渣浸提液均对溃疡病菌有一定的抑制作用,其中油茶饼浸提液的抑制作用最好,其次为菜籽饼和花生饼。耐温性实验表明,70℃处理4 h以上或者80℃处理1 h以上,可使火龙果溃疡病病原菌致死。3.火龙果老熟组织的蜡质层是抵御溃疡病病菌的侵染的重要屏障。火龙果的幼嫩组织容易感染溃疡病,而老熟组织不容易感病。实验表明,火龙果老茎枝条有蜡质层时,侵染不感病,去掉蜡质层以后侵染组织会感病。为研究其原因,对火龙果老嫩枝条进行了扫描电镜对比研究,表皮外观显示:火龙果嫩茎的蜡质层表面凹凸不平,细胞结构疏松,褶皱较多,尤其是气孔周围,可能有利于病菌的附着与定殖;火龙果老茎的蜡质层表面光滑,细胞结构紧密,不利于病菌生长。表皮的横切面显示:嫩茎的蜡质排列松散,细胞内容物填充少,蜡层之间存在空隙;老茎的蜡质排列紧密,细胞内容物填充饱满,蜡质分布均匀。以上结果从物理屏障层面上解释了火龙果嫩枝条易感病而老枝条不易感病的原因。与红肉火龙果蜡质层相比,白肉火龙果嫩茎蜡质排列相对致密,而老茎内部蜡质层填充则更加紧实。蜡质层代谢组学表明,火龙果蜡质层主要由脂类;有机氧化合物;苯丙酸和聚酮;核苷、核苷酸和类似物;苯环型化合物等组成。鉴定到的差异离子主要参与代谢物、次生代谢物、萜类、生物碱类、不饱和脂肪酸等相关Pathway过程。嫩茎与老茎、红肉与白肉蜡质层的差异主要是由脂类的种类和含量决定的,构成火龙果蜡质层的脂质主要包括脂肪酰类、甘油糖脂、甘油磷酯、聚酮类等八类。组成嫩茎和老茎蜡质层的成分、种类、含量差异较大而不同品种之间同一时期状态下的蜡质层的成分、种类、含量差异不大。扫面电镜结果结合代谢组学的结果在一定程度上解释了嫩茎易感病而老茎不感病以及白肉比红肉更抗病,但差异并不十分明显的原因。4.火龙果对溃疡病抗性的转录组比较研究。通过对正常和感溃疡病的火龙果茎植株进行转录组测序比较,共得到了 151.88 Mb Raw Reads和144.01 Mb Clean Reads数据;组装得到了 33584个Unigene;Unigene的N50分布在610 bp-1081 bp之间;GC含量在40%-50%之间,以上数据显示总体的测序和组装的质量较好。qRT-PCR实验结果与转录组RNA-Seq测序结果一致率为87%,转录组测序的稳定性和可靠性比较好。将Unigene与已测序的物种进行比对发现,火龙果可能与葡萄、可可、荷花、麻风树等具有较高的物种同源性。鉴定到832个编码植物转录因子的Unigene,主要包括 MYB、MYB-related、AP2-EREBP、C3H、WRKY、bHLH、NAC、GRAS 等家族。本研究中,共鉴定到了 1073个差异表达基因(DEGs),其中显著上调的有1032个,显著下调的有41个。DEGs的GO分析表明,大部分DEGs显著富集在催化活性、细胞膜、细胞过程、代谢过程、结合进程等功能区域。Pathway分析表明,多数DEGs显著富集到植物-病原菌互作、RNA转运、氨基糖和核糖代谢等Pathway通路。其中在植物与病原菌互作的pathway筛选到了 13类、共24个DEGs参与抗病的Unigene。这些Unigene主要编码钙离子依赖的蛋白激酶、Rboh、CNGCs、钙调蛋白相关、FLS、WRKY家族转录因子等。5.火龙果HpLRR和HpPR是两类重要的抗病基因。利用转录组学,鉴定了两类重要的抗病家族基因HpLRR和HpPR。生物信息学分析表明火龙果HpLRR家族的基因主要包括LRR-STK、FBXL、NBS-LRR、LRR-RLK、PIRL等亚家族,具有典型的LxxLxLxxNxL保守结构域。PR家族的基因主要包括病程相关蛋白、病程相关基因转录激活子、病程相关Bet vⅠ家族蛋白,这些蛋白多数为小分子蛋白,无典型的保守区域结构。组织特异性表达、不同侵染时期基因的表达及水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)处理后的HpLRR和HpPR家族基因表达实验表明,这些基因在不同的组织、不同的品种、不同表达时期以及抗病相关激素处理下的表达量不同。生物信息学分析结合表达分析实验表明,HpLRR和HpPR这两类基因普遍参与抗病进程。6.火龙果HpPR1是参与其抗溃疡病的关键基因。火龙果HpPR1基因编码166个氨基酸,是一种富含半胱氨酸的小分子分泌型蛋白,该蛋白前28个氨基酸编码一个前导信号肽序列,是CAP超级家族成员。亚细胞定位结果显示HpPR1蛋白定位于细胞膜。酵母双杂交实验表明诱饵表达载体HpPR1-pGBKT7本身没有自激活活性且对酵母Y2H Gold细胞无毒性;酵母双杂交筛库共筛到了五类与HpPR1蛋白互作的蛋白,分别是:仙人掌抑制类蛋白、仙人掌病毒X分离物Rep/(TGB1,TGB2,TGB3)/CP、甘露醇脱氢酶、叶绿体以及半胱氨酸蛋白酶,已有的研究表明这些蛋白普遍参与抗病进程。
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