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戊型肝炎作为一种经粪-口途径传播的急性传染病，主要流行于亚洲、非洲、中美洲等发展中国家和地区。其病毒基因组是单股线状正链RNA，长约7.5kb，由5′非编码区、编码区和3′非编码区组成，编码区包括三个开放读码框架（ORFs）。其中结构基因ORF2位于基因组的3′端，长1980bp，编码病毒的结构蛋白。本实验采用戊型肝炎病毒（HEV）新疆流行株（CH1.1）ORF2区3′端cDNA片段492bp，插入到融合蛋白表达载体pGEX-4T-3，转化至大肠杆菌TG-1进行表达，以获得的GST-HEV融合蛋白作为抗原，应用于酶免疫检测（EIA）中。一、HEV目的基因的扩增 采用RT-nPCR法，扩增HEV ORF2区的核苷酸序列，目标长度为492bp，称为HEV ORF2 cDNA。二、目的基因与融合蛋白表达载体pGEX-4T-3重组体的构建 BamHI/EcoRI双酶切PCR扩增产物和pGEX-4T-3质粒，T4连接酶连接酶切产物，转化至感受态细胞TG-1，碱裂解法提取质粒DNA。经酶切、PCR鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪下均可见约500bp阳性条带，从而筛选出含目的HEV基因片段的重组质粒DNA，序列分析证实该重组质粒插入序列确为HEV ORF2序列，且阅读框架完全正确，说明重组表达质粒（称为pGEX-4T-3-HEV）构建成功。与HEV缅甸株ET1.1的核苷酸序列比较，同源性为92.9％。三、pGEX-4T-3-HEV重组体在大肠杆菌中的表达 重组体菌株经IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE电泳，在46KD处可见一蛋白条带。Western blot鉴定结果表明，1:100抗-HEV阳性血清与之呈阳性反应。 四、重组抗原在EIA诊断中的初步应用 以表达的融合蛋白包被反应板，应用于抗AIEV EIA检测。测定戊型肝炎病人血 清 97份，与 Genelabs试剂盒比较，一致率为 96．9％。检测 6份甲肝、11份乙肝、 12份丙肝、8份丁肝、10份庚肝血清，其中1份丁肝及1份庚肝血清抗－HEV阳性， 其余标本均为阴性。 结论： 1．成功构建了HEV ORFZ cDNA克隆重组体。 2．PGEX－4T－卜HEV重组体通过大肠杆菌表达产生一46KD的融合蛋白。 3．重组的融合蛋白初步应用于抗－HEV EIA检测，与Genelabs试剂盒比较一致率 高。