在细胞中,DNA转录生成信使RNA前体（precursor messenger RNA,pre-mRNA）,pre-mRNA经过可变剪接得到成熟的信使RNA（messenger RNA,mRNA）,mRNA指导蛋白质的合成,这是生命科学的基本过程。在这一过程中,可变剪接是蛋白质多样性的主要原因。异常剪接与一些疾病有关,如帕金森症、脊肌萎缩症、癌症等。研究表明,一种疾病是可变剪接过程中多种异常剪接共同作用的结果。因此,建立高灵敏度、高特异性同时检测多种剪接变体的方法具有重要意义。RNA测序（RNA sequencing,RNA-seq）已成为在全转录组范围内分析差异基因表达和mRNA差异剪接不可或缺的工具。RNA-seq以前所未有的深度和准确性分析转录组,在哺乳动物组织和器官中发现了几千种新的RNA转录变体,这极大地促进了我们对哺乳动物基因表达调控和网络复杂性的理解。对于RNA-seq,直接测序会导致低丰度信息的丢失,一般需要对RNA进行扩增,即制备文库。文库的制备过程直接影响测序结果,因此,提高文库的制备效率对RNA测序具有重要意义。本论文中,我们建立了基于核酸扩增技术高灵敏、高特异性、多重检测端粒酶的3种mRNA剪接变体的分析方法;为了提高检测通量,我们建立了基于编码探针长度检测与乳腺癌密切相关的6种mRNA剪接变体的分析方法;为了提高Oxford纳米孔测序的准确度,我们基于环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP）建立了 mRNA 文库构建的新方法。（1）我们建立了基于连接的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）检测mRNA剪接变体的方法。以mRNA剪接变体为靶标,在剪接位点处设计一对特异性的DNA探针,在SplintR连接酶的催化作用下连接两个探针。使用一对通用引物对连接产物进行PCR扩增,在扩增的过程中加入3种不同荧光基团（FAM、VIC、NED）修饰的TaqMan探针,通过实时监测荧光信号实现多重检测。该方法使用可高效识别单碱基差异的SplintR连接酶保证检测的特异性、使用通用PCR引物减少扩增偏差、利用不同荧光基团修饰的TaqMan探针实现剪接变体的多重检测。基于此,该方法实现了剪接变体的高灵敏度、高特异性和多重检测,检出限低至10 aM;并且该方法成功应用于宫颈癌细胞等生物样品中剪接变体的定量分析。（2）荧光基团之间的光谱重叠限制了商用TaqMan探针的检测通量,最多可同时检测4种靶标。为了提高检测通量,我们建立了基于编码探针长度的逆转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）检测mRNA剪接变体的方法。以mRNA剪接变体为靶标,在剪接位点处设计一对特异性的用于逆转录和延伸反应的DNA探针PA和PB,在ProtoScript Ⅱ逆转录酶的催化作用下PA进行逆转录得到第一链cDNA。以第一链cDNA为模板,PB在Phusion HotStart Flex DNA聚合酶的催化作用下延伸得到双链DNA。利用一对通用引物对双链DNA进行PCR扩增,针对不同靶标编码不同长度的探针,得到不同长度的PCR扩增产物,利用毛细管电泳对PCR产物实现分离检测。该方法实现了对6种剪接变体的同时检测,检出限低至100 aM。该方法采用具有单碱基区分率的毛细管电泳有望实现几十种剪接变体的同时检测。最后该方法成功应用于人乳腺癌细胞等生物样品中剪接变体的定量分析。（3）Oxford Nanopore Technology（ONT）的纳米孔测序仪由于仪器和测序成本低、仪器体积小便于携带、测序速度快等特点得到了广泛的应用,然而,其测序的准确度有待提高。LAMP产物是一系列具有重复单元的长双链DNA,非常适合于纳米孔测序。通过LAMP产物的自我校正,纳米孔测序的准确度大大提高。因此,我们建立了基于多次退火环状循环扩增（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles,MALBAC）技术结合 LAMP构建mRNA文库的方法。利用oligo（dT）引物将mRNA逆转录形成cDNA,在RNase H酶的作用下将与cDNA杂交的mRNA水解。以带有8个随机碱基的茎环DNA分子为MALBAC引物,对cDNA进行MALBAC循环得到大量双茎环结构DNA。该DNA作为LAMP扩增的初始模板进行扩增,将扩增产物进行后续的上机文库的构建,利用Oxford纳米孔测序仪进行测序。基于MALBAC结合LAMP技术构建的mRNA文库与hg19基因组数据库进行比对,共比对到了 136个基因,且通过LAMP序列的相互校正提高了测序的准确度。