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蛇毒由复杂的蛋白和多肽组成,在进化过程中由于捕食和消化模式的不同,蛇毒组分表现出较大的种内差异。本研究选用短尾蝮蛇(Gloydius brevicautus)、五步蛇(Deinagkistrodon acutus)和舟山眼镜蛇(Naja atra)成幼体为对象,对蛇毒蛋白质表达谱及酶活性进行分析。主要研究内容和结论如下：1.低丰度蛋白富集双向电泳检测技术可能会忽视部分低含量蛋白,低丰度蛋白富集技术能改进这一缺陷。本实验分别使用pH3.8、pH7.2和pH9.0三种不同的样品溶解液对短尾蝮成体蛇毒蛋白进行抽提,SDS-PAGE电泳结果显示：与原始样品相比,pH7.2抽提的样品新增了4个条带,分别为120kDa、70kDa、23kDa、26kDa；pH9.0结果中有三个蛋白条带颜色更深,40kDa、18.4kDa和8kDa。pH3.8与其它两种条件相比,效果不显著。2.三种毒蛇成幼体蛇毒蛋白表达谱差异以及酶活性分析蛇毒组分和酶活性都会随着毒蛇年龄不同而发生改变。短尾蝮、五步蛇和舟山眼镜蛇成幼体蛇毒蛋白电泳图谱均存在显著差异。垂直电泳结果显示短尾蝮蛇毒蛋白条带数量多于其他两种毒蛇。舟山眼镜蛇幼体高分子量蛋白(>116.0kDa)含量更高,成体中分子量45kDa-66.6kDa区域蛋白含量也明显低于幼体,另外,-20kDa蛋白带是幼体特有的。但是分子量66.2kDa蛋白条是成体特有的,幼体中几乎没有发现。五步蛇毒成体有3个特有蛋白带,分别为～40kDa、18.4kDa、16kDa；23kDa和24kDa是幼体特有蛋白带。短尾蝮成幼体蛇毒蛋白条带差异显著,主要表现在分子量45kDa和66.2kDa之间以及分子量25kDa与18.4kDa之间。2-DE结果显示,短尾蝮成幼体蛇毒蛋白的重叠率为29%,成体图谱中蛋白点数量为155,幼体为199,其中成幼体共同蛋白点为46个五步蛇成体图谱中的蛋白点数量为112,幼体为146,其中22个蛋白点是成幼体共有的。舟山眼镜蛇成体图谱中的蛋白点数量为104,幼体为85,有35个共同蛋白点,重叠率为33%。短尾蝮成幼体蛇毒蛋白5’核苷酸酶活性差异不显著,但是五步蛇和舟山眼镜蛇成幼体蛇毒的5’核苷酸酶活性存在显著差异：五步蛇成体具有更高的5’核苷酸酶活性,眼镜蛇幼体蛇毒5’核苷酸酶高于成体。成幼体短尾蝮和舟山眼镜蛇毒蛋白的L-氨基酸氧化酶活性都没有明显差异。而在五步蛇中,该酶活性只存在于成体蛇毒中,幼体中没有发现。三种毒蛇成体蛇毒的蛋白酶水解活性均小于幼体。五步蛇和眼镜蛇成体蛇毒碱性单磷脂酶活性小于幼体,短尾蝮蛇毒则相反。乙酰胆碱酯酶只存在于眼镜蛇中,五步蛇和短尾蝮蛇毒中没有检测出该活性。五步蛇成幼体蛇毒均存在较强的明胶水解活性,短尾蝮蛇毒中该活性要弱些,舟山眼镜蛇毒中未发现明显的明胶水解活性。3.短尾蝮成幼体蛇毒差异组分的质谱鉴定和相对定量此部分的研究中,我们同时应用双向电泳(2-DE)、LC/MS/MS以及iTRAQ (isobaric tag labeling)技术对不同发育阶段蛇毒蛋白进行质谱鉴定和相对定量。双向电泳分析研究中,我们应用了pH值窄范围胶条(pH4-7),结果使图谱中的蛋白点分得更开,获得了较为直观的图谱。使我们可以看出有些在pH3-10的图谱中看不到的蛋白点也显示出来了。特别是pH4-5.5蛋白分子量为66.2-116.0kDa之间的蛋白点。该区域中幼体图谱中的蛋白点数量比成体要多,这些蛋白主要是Ⅲ-型金属蛋白酶。该区域中幼体图谱中的蛋白点浓度明显高于成体,也就是说幼体蛇毒蛋白中Ⅲ-型金属蛋白酶浓度比成体高。然而,成体图谱中pH6-7分子量25kDa范围的蛋白点比明显多于幼体,这些蛋白点是Ⅰ-型金属蛋白点。本次双向电泳分析中发现金属蛋白酶从富含Ⅲ-型金属蛋白酶向富含Ⅰ-型金属蛋白酶发生明显转变。iTRAQ对蛇毒量变的分析结果显示,幼体蛇毒中金属蛋白酶含量丰富,相反,发现成体蛇毒蛋白中丝氨酸蛋白的含量更高。富含半胱氨酸的分泌蛋白幼体蛇毒总含量更高,但是L-氨基酸氧化酶和磷脂酶A2在成体中含量更高。