论文部分内容阅读
巨噬细胞转移抑制因子是哺乳动物的促炎症因子,与其他细胞因子不同的是,巨噬细胞转移抑制因子具有氧化还原酶和互变异构酶活性。这个高度保守的蛋白同系物在不同的物种中都存在,其中也包括寄生虫。本研究主要针对奥氏奥斯特线虫巨噬细胞转移抑制因子同系物进行研究。通过比对分析得出,OoMIF与Teladorsagia circumcincta MIF (TciMIF)虽然没有相同的核苷酸序列,但其氨基酸的同源性达到了l00%,说明OoMIF和TciMIF是完全相同的蛋白。本研究通过原核表达系统分别表达OoMIF和OoMIF的突变体,该突变体将第二位的脯氨酸突变为甘氨酸。结果分析发现重组的OoMIF和OoMIF的突变体均不具备氧化还原酶活性,但OoMIF展现出很好的互变异构酶活性,其活性单位为105μmol/min/mg,ISO-1抑制试验证明,人类的MIF的抑制剂不能够完全抑制OoMIF的互变异构酶活性。OoMIF具有一定的抑制单核细胞移动作用但不是非常的明显,能够与人类MIF竞争与受体CD74结合且能后被巨噬细胞摄入胞内。L3和L4阶段线虫的OoMIF含量很高,且主要位于分泌蛋白和排泄物抗原中。本研究也证明OoMIF能够促进牛PBMC和U937细胞分泌IL-8and TNFа细胞因子。证明OoMIF在线虫感染牛的过程中,很可能在调节宿主的免疫系统起到一定的作用。本研究为建立简单、便捷、快速的PCR检测方法对奥氏奥斯特线虫进行鉴别诊断,以GenBank公布的Ostertagia ostertagi间隔区ITS-2(登录号为AB245023.2)为靶基因,利用分子生物学软件Primer Primier5.0设计一对特异性PCR引物,通过对PCR反应体系中的Mg2+浓度、dNTP添加量、引物浓度、Taq酶添加量及退火温度分别进行优化,以确定PCR的最佳反应条件,结果证明其适宜反应浓度为:3mM Mg2+,0.25mM dNTP,0.5μM引物浓度,0.5μL Taq酶(5U/μL),其扩增最适退火温度为57°C。对PCR扩增产物测序结果证明其与GenBank公布的ITS-2序列的同源性达100%,从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。本研究同时建立了简单、便捷、快速的荧光定量PCR检测方法对奥氏奥斯特线虫进行鉴别诊断,以Ostertagia ostertagi ITS-2为靶基因,建立检测奥氏奥斯特线虫的荧光定量PCR检测方法。通过分子生物学软件设计一对特异性荧光定量PCR引物,通过优化反应条件,并对实时荧光定量PCR的特异性、敏感性、可靠性的检测。通过标准质粒的构建,生成标准曲线,曲线方程为:Y=-3.425x+39.79,曲线的相关系数R2=0.998,实验结果证明SYBR Green I荧光定量PCR能检测虫卵的最低浓度为1×103拷贝/μL,而普通PCR能检测的最低模板浓度为1×105拷贝/μL。表明该方法检测虫卵ITS-2的灵敏度是普通PCR的100倍。本研究还以Ostertagia ostertaigi ITS-2为靶基因,运用在线引物设计软件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)建立了LAMP快速诊断方法。采用以上三种方法对50份已知样品进行检测,结果显示:本研究采用的PCR方法敏感性为90%,特异性为100%,符合率为94%;而荧光定量PCR方法实际应用中的敏感性为100%,特异性为100%,符合率为100%; LAMP方法实际应用中的敏感性为96.6%;特异性为100%;符合率为98%,所以荧光定量PCR方法的各项指标优于PCR和LAMP方法。