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革兰氏阴性菌种类繁多,以大肠杆菌、痢疾杆菌、布氏杆菌等为代表,由此引发的家畜炎症疾病可导致败血症、乳腺炎、生殖系统感染等,给畜牧养殖业带来极大损失。内毒素又名脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要毒力因子,能激活细胞膜上多种受体如TLRs进行跨膜及胞内信号传导,释放炎性介质,诱发机体过度炎症损伤。髓系细胞触发受体-1（TREM1）是一种细胞膜模式识别受体,通过TREM1/DAP12信号通路放大LPS炎症反应。脂多糖结合蛋白（LBP）具有LPS高亲和力,属于TLR4信号通路上游关键蛋白。TREM1和LBP均能级联扩大炎症信号,对LPS信号传导至关重要。研究表明,沉默或敲除TREM1或LBP基因表达,可显著降低炎性介质表达并控制过度炎症,且TREM1与TLR4信号通路存在协同互作。为了深入了解水牛TREM1和LBP基因在LPS致炎反应中的作用及其致炎信号传导分子调控机制,本研究以水牛外周血单核巨噬细胞为材料,以慢病毒载体介导的RNA干扰和转录组学技术为主要手段,研究体外抑制TREM1或LBP基因表达对LPS诱导下相关基因表达的影响及其分子调控机制,为提高水牛抗病能力奠定理论基础。主要研究结果:1、原代水牛外周血单核巨噬细胞的分离培养为了获取生长状态良好的水牛原代单核巨噬细胞,首先对其进行分离纯化,比较自体血清浓度对细胞贴壁生长状况的影响,利用墨汁吞噬、流式及qRT-PCR方法对纯化后细胞进行鉴定。结果显示,细胞在含有2.5%自体血清培养液中贴壁能力高于5%、7.5%;纯化细胞特异性表达TREM1及CD14基因,且流式鉴定细胞表面抗原CD14和MHC-Ⅱ 阳性率达98.50%。2、抑制TREM1基因表达对LPS诱导下水牛单核巨噬细胞炎症相关基因表达的影响为了探讨抑制TREM1基因表达对LPS诱导下水牛单核巨噬细胞炎症相关基因表达的影响,首先对TREM1-shRNA294重组质粒进行慢病毒包装,摸索靶细胞感染适宜条件,之后qRT-PCR和ELISA方法进行检测。结果显示,在病毒滴度>4×108IU/mL、感染指数（MOI）为300、感染时间为7d的条件下,细胞感染效率超过50%。与LPS对照组相比,感染组TREM1基因表达量降低69%,DAP12、TLR4、MYD88、TNF-α、IL-1β等基因表达显著降低（P<0.05）。TREM1-shRNA 组的 TNF-α含量（418.23 pg/mL）显著低于对照组（604.92 pg/mL,P<0.05）,且 IL-1β含量（230.65 pg/mL）亦显著低于对照组（387.12pg/mL,P<0.05）。3、抑制LBP基因表达对LPS诱导下水牛单核巨噬细胞炎症相关基因表达的影响为了探讨抑制LBP基因表达对LPS诱导下炎症相关基因的表达,采用上述相同方法,另以TREM1-sh294和LBP-sh774慢病毒联合感染细胞。结果显示,纯化病毒滴度>5 × 108IU/mL;与LPS组相比,感染组LBP、CD14、TLR4、TNF-α、IL-1β、IL-8等基因表达显著降低（P<0.05）。上清液TNF-α、IL-1β及可溶性LBP（sLBP）的蛋白分泌含量均显著低于LPS组（P<0.05）。不同比例病毒组TREM1和LBP shRNA共同抑制实验结果表明:与LPS组相比,各比例组中TNF-α、IL-1β基因表达及蛋白分泌水平均显著降低（P<0.05）;当2:1联合感染时,Bcl-2基因表达显著降低而Caspase-3显著升高（P<0.05）;。4、TREM1/LBP基因表达下调的水牛单核巨噬细胞转录组学分析为了更全面解析TREM1/LBP基因沉默对LPS致炎信号传导的分子调控机制,利用RNA-seq方法对TREM1-sh、LBP-sh和NC（LPS单独刺激）3个微量细胞样本测序,应用生物信息学方法对差异表达基因分析,并对其进行qRT-PCR验证。结果发现,与NC组比较,TREM1-sh和LBP-sh组的差异表达显著变化基因分别为1355和897个;与LBP-sh组相比,TREM1-sh有2536个（P<0.001）。GO及KEGG富集分析,差异基因主要在细胞免疫、免疫过程、抗原递呈等生物进程,NF-kB、细胞因子互作等代谢路径富集;TREM1-sh亦富集于JAK/STAT、抗原递呈等。3个组两两比较中共同差异表达基因182个,其中9个与炎症反应相关,即NFKBIB、TNFRSF13B、TNFRSF17、IL-26、C5AR1、HIF1A、IL2RA、IL-8、MMP-9,可能通过参与 HIF-1A/C5AR1/细胞因子互作、STAT/TNFSF/NF-kB/IL-8/MMP-9、LBP/TREM1互作等信号传导路径来发挥联合抑制作用。以上结果表明,抑制TREM1/LBP基因表达可以有效降低LPS诱导下单核巨噬细胞炎症相关基因的表达,调控LPS炎症反应,TREM1信号通路与LBP信号传导路径之间存在协同互作关系。