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研究背景神经病理性疼痛（neuropathic pain,NP）是损害或疾病累及躯体感觉系统后直接导致的疼痛,是外周和中枢神经系统之间复杂机制相互作用的结果,是疼痛综合征中最难治愈的。瞬时受体电位通道（transient receptor potential,TRP）是哺乳动物组织中普遍存在的离子通道,广泛分布于中枢和外周神经系统中,涉及感受温度、有毒物质和疼痛,在免疫应答和伤害感受中起重要作用。瞬时受体电位通道A1（transient receptor potential cation channel,subfamily A,member l,TRPA1）是TRP通道超家族的非选择性钙通透性阳离子通道,是多种化合物的刺激传感器,在伤害性信号的传递整合中起着至关重要的作用。以往研究表明,TRPA1在初级感觉神经元末梢高表达,可介导神经元胞质内Ca2+释放,增强神经元的兴奋性,在疼痛信号最上游介导伤害感受。除初级感觉神经元外,TRPA1也存在于脊髓背角神经元及一些非神经组织细胞,有报道称脊髓水平TRPA1参与维持慢性背根神经节压迫模型所致神经病理性疼痛,但具体机制仍不清楚。钙/钙调素依赖性蛋白激酶2（calcium/calmodulin-dependent protein kinase2,CaMK2）是一种多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,胞内Ca2+浓度增加可刺激CaMK2磷酸化,活化的磷酸化CaMK2参与了各种伤害性刺激的感觉处理过程,其中包括伤害性剌激的脊髓传输。环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein,CREB）是一种核转录因子,能够刺激基因转录。活化的CaMK2能够磷酸化CREB,提高CREB转录活性,进而调节靶基因的转录,参与形成痛觉的持续状态及痛觉过敏。以往研究发现,TRPA1激活剂AITC激活心肌细胞内TRPA1离子通道时,细胞内Ca2+峰剂量依赖性增加,并激活CaMK2依赖性信号通路,最终增强心肌细胞的收缩功能。然而脊髓内TRPA1是否在大鼠选择性神经损伤（Spared nerve injury,SNI）所致神经病理性疼痛中发挥作用以及TRPA1是否通过CaMK2-CREB通路参与神经病理性疼痛的发生发展,目前仍未有报道。研究目的本研究采用大鼠选择性神经损伤SNI模型,首先观察脊髓腰膨大TRPA1表达情况及具体分布的细胞类型,并证明TRPA1在神经病理性疼痛发生发展中的作用。然后对TRPA1参与SNI模型所致神经病理性疼痛可能的下游分子机制即TRPA1是否激活CaMK2-CREB信号转导通路介导神经病理性疼痛做进一步的探索。研究方法1大鼠选择性神经损伤模型术后脊髓腰膨大中TRPA1的表达变化及分布的细胞类型为观察SNI大鼠疼痛行为学及术后脊髓腰膨大中TRPA1的表达情况,雄性SD大鼠随机分为手术组（SNI组）和假手术组（Sham组）（n=15）,于术前3天、1天和术后1、3、5、7、9、12、14天测定大鼠机械刺激撤足阈值（Paw withdrawal threshold,PWT）,各组于0天、术后3、7、14天分别取3只大鼠,Western Blot检测术侧脊髓腰膨大TRPA1的表达水平。测痛完成后取SNI术后14天大鼠脊髓腰膨大,运用免疫荧光双标染色技术检测TRPA1与神经元标记物NeuN、星形胶质细胞标记物GFAP、小胶质细胞标记物IBA1的共标情况,观察TRPA1在脊髓中表达的细胞类型。2鞘内注射TRPA1抑制剂HC-030031对大鼠选择性神经损伤模型神经病理性疼痛行为学的影响（1）为观察TRPA1抑制剂HC-030031预先给药对神经病理性疼痛发生的影响,鞘内置管成功大鼠随机分为6组（n=9）:Sham+Vehicle组、SNI+Vehicle组、SNI+HC-030031 10μg组、SNI+HC-030031 50μg组、SNI+HC-030031 100μg组和HC-030031 100μg组,术前30分钟鞘内注射TRPA1抑制剂HC-030031或Vehicle预处理,术后每天一次至术后7天,于术前3天、1天和术后1、3、5、7、9、12、14天测定大鼠PWT。最后一次给药后2小时取大鼠术侧脊髓腰膨大,Western Blot检测CaMK2、CREB的表达水平。（2）为观察TRPA1抑制剂HC-030031对已经建立起的神经病理性疼痛的影响,鞘内置管成功大鼠随机分为3组（n=6）:Sham+Vehicle组、SNI+Vehicle组和SNI+HC-030031 100μg组,术后第7天开始鞘内注射HC-030031或Vehicle,每天一次连续5天,于术前3天、1天和术后1、3、5、7、9、11、14天测定大鼠PWT。Vehicle:10%DMSO。3 TRPA1激活剂AITC对大鼠行为学的影响（1）为观察AITC激活外周神经TRPA1对大鼠行为学的影响,雄性SD大鼠随机分为3组（n=6）:Vehicle组、AITC 100μg组和AITC 300μg组,大鼠左侧足底皮下注射TRPA1激活剂AITC或Vehicle,于足底注药前3天、1天和注药后0.5h、1h、2h、1、3、5、7天测定大鼠PWT。（2）为观察鞘内预先阻断TRPA1对外周激活TRPA1行为学的影响,鞘内置管成功大鼠随机分为2组（n=6）:Vehicle+AITC 300μg组和HC-030031 100μg+AITC 300μg组,鞘内注射HC-030031 100μg或Vehicle预处理,30分钟后左侧足底皮下注射AITC 300μg,于注药前3天和注药后1、3、5、7天测定大鼠PWT。（3）为观察鞘内注射TRPA1激活剂AITC对大鼠行为学及下游分子的影响,鞘内置管成功大鼠随机分为4组（n=6）:Sham+Vehicle组、SNI+Vehicle组、SNI+AITC 10μg组和AITC 10μg组,于术前30分钟鞘内注射AITC 10μg或Vehicle预处理,术后每天一次至术后7天,于术前3天、1天和术后1、3、5、7天测定大鼠PWT。最后一次测痛后取大鼠术侧脊髓腰膨大,Western Blot检测CaMK2、CREB的表达水平。Vehicle:10%DMSO。4 TRPA1-CaMK2-CREB信号通路对神经病理性疼痛的影响通过以上实验已得出TRPA1抑制剂及激活剂对大鼠行为学及下游分子CaMK2、CREB表达影响的结果,为进一步研究TRPA1通过CaMK2调控CREB表达的机制,雄性SD大鼠随机分为4组（n=3）:Vehicle组、AITC组、AITC+KN-93组和KN-93组,鞘内注射TRPA1激活剂AITC 10μg预处理,2小时后鞘内注射CaMK2阻断剂KN-93 50μg或Vehicle,最后一次给药6小时后取大鼠脊髓腰膨大,Western Blot检测CREB的表达水平。Vehicle:10%DMSO。结果1大鼠选择性神经损伤引起大鼠痛觉超敏以及术侧脊髓背角TRPA1表达升高SNI手术诱导大鼠产生机械性痛觉超敏,疼痛行为学测试显示,与假手术组相比,大鼠SNI术后1天PWT出现明显下降,并持续至术后14天观察结束。Western Blot结果显示,SNI引起术后脊髓腰膨大中TRPA1表达逐步升高。免疫荧光结果显示SNI术后14天术侧脊髓背角TRPA1受体表达水平明显上调,上调的TRPA1与神经元标记物NeuN、星形胶质细胞标记物GFAP大量共标,与小胶质细胞标记物IBA1共标较少。2 TRPA1抑制剂HC-030031可减轻神经损伤后大鼠机械性痛觉超敏（1）大鼠鞘内注射TRPA1抑制剂HC-030031（术前30分钟开始鞘内注射,每天一次,持续至术后7天）时,疼痛行为学测试显示,与SNI+Vehicle组相比,HC-030031呈剂量依赖性地升高SNI术后大鼠PWT,100μg效果最佳,10μg效果不明显。结果表明高剂量HC-030031的鞘内应用可抑制SNI手术所致机械性痛觉超敏。Western Blot结果显示,HC-030031下调神经损伤后大鼠术侧脊髓腰膨大CaMK2和CREB的表达水平。（2）大鼠鞘内注射TRPA1抑制剂HC-030031 100μg（术后7天开始鞘内注射,每天一次,连续5天）时,疼痛行为学测试显示与SNI+Vehicle组相比,HC-030031显著升高SNI术后7、9、11天大鼠PWT。结果表明,在神经病理性疼痛形成后,HC-030031仍能减轻大鼠疼痛。3 TRPA1激活剂AITC可诱导大鼠产生机械性痛觉超敏（1）足底皮下注射TRPA1激活剂AITC引起大鼠急性的机械性痛觉超敏,疼痛行为学测试显示,与足底注射Vehicle组相比,大鼠足底注射AITC后0.5小时PWT出现显著降低,除注药后7天其余各时间点PWT均有显著差异;AITC100μg组和AITC 300μg组相比,PWT无明显差异。（2）鞘内预先注射TRPA1抑制剂HC-030031 100μg可有效减轻足底注射AITC 300μg引起的机械性痛觉超敏,疼痛行为学测试显示,鞘内预先注射HC-030031 100μg组大鼠PWT在AITC 300μg足底注射后1、3、5天显著优于鞘内预先注射Vehicle组。（3）鞘内注射TRPA1激活剂AITC 10μg（术前30分钟开始鞘内注射,每天一次,持续至术后7天）引起大鼠PWT逐步降低,结果表明,脊髓水平激活TRPA1可引起大鼠机械性痛觉超敏。Western Blot结果显示,TRPA1激活剂AITC上调正常大鼠和神经损伤后大鼠术侧脊髓腰膨大CaMK2和CREB的表达水平。4 TRPA1-CaMK2-CREB信号通路参与神经病理性疼痛的发生发展Western Blot结果显示,与AITC组相比,AITC+KN-93组大鼠CREB表达显著降低,结果表明,CaMK2阻断剂可抑制AITC引起的CREB表达升高,脊髓背角TRPA1通过CaMK2调控CREB的表达。结论大鼠选择性神经损伤引起术侧脊髓背角TRPA1表达增加并可能通过CaMK2-CREB信号通路参与神经病理性疼痛的发生发展。