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油茶是我国特有的后期自交不亲和性的木本食用油料树种,但其后期自交不亲和的分子机制尚不清楚,不利于油茶品种配置的优化、栽培技术措施的制定和单位面积产量的提高。为解析油茶自交不亲和的分子机制,本实验室课题组构建了油茶雌蕊和花粉转录组数据库,经分析发现束状阿拉伯半乳糖蛋白(FLAs)很可能参与了油茶自交不亲和的过程。为此,本文以我国主要栽培品种‘华硕’和‘华金’为试验材料,开展了油茶CoFLAs基因的克隆与生物学功能解析研究。主要结果如下:1.油茶CoFLAs基因的克隆。根据转录组数据设计特异引物,克隆了 7个CoFLA基因的全长CDS序列和gDNA序列,发现这7个基因均没有内含子,依次被命名为 CoFLA1、CoFLA2、CoFLA3、CoFLA4、CoFLA5、CoFLA6 和 CoFLA7,长度依次为 849 bp、1233 bp、1176 bp、1263 bp、1239 bp、771 bp 和 1401 bp。同源序列比对发现,它们依次与茶树CsFLA3、水芙蓉NnFLA1、茶树CsFLA2、茶树CsFLA8、茶树CsFLA4、茶树CsFLA7、茶树CsFLA16的相似性最高。系统进化树分析表明,它们依次与AtFLA14、AtFLA1、AtFLA1、AtFLA8和AtFLA10、AtFLA4、AtFLA7、AtFLA15～AtFLA18 的亲缘关系最近。CoFLAl、CoFLA2、CoFLA3、CoFLA4、CoFLA6 和 CoFLA7 有信号肽,CoFLA1、CoFLA2、CoFLA3、CoFLA5有GPI锚定位点。它们均含有1～2个FAS结构域及H1、[Y/F]-H和H2这三个保守结构域。这些都是FLAs蛋白的主要结构特征。2.油茶CoFLAs基因的表达模式。通过实时荧光定量PCR的方法,探究了油茶CoFLAs基因在不同部位以及自异交授粉后不同时间花柱和子房中的表达模式。在不同部位中,CoFLA1基因在花粉中特异表达,CoFLA2和CoFLA5基因主要在叶中大量表达,CoFLA3基因主要在根和叶中大量表达,CoFLA4基因在茎中大量表达,CoFLA6基因在叶、茎和花粉中大量表达,CoFLA7基因在叶和茎中大量表达。在花柱和子房中,油茶CoFLAs基因的表达趋势均能分为四类。在花柱的四类表达趋势中,CoFLA1、CoFLA3和CoFLA7基因属于第一类,CoFLA4和CoFLA6基因属于第二类,CoFLA5基因属于第三类,CoFLA2基因属于第四类,这四类均在2-48 h时间段内自交、异交差异较大。在子房的四类表达趋势中,CoFLA2和CoFLA7属于第一类,CoFLA3和CoFLA5属于第二类,CoFLA4和CoFLA6属于第三类,CoFLA1属于第四类。3.油茶CoFLAs基因的亚细胞定位。通过同源重组的方法,把7个去掉信号肽的 CoFLA1、CoFLA2、CoFLA3、CoFA4、CoFLA5、CoFLA6和CoFLA7基因序列以及4个去掉信号肽和GPI锚定序列的CoFLA1、CoFLA2、CoFLA3、CoFLA5序列成功连接到带有GFP荧光蛋白的pCAMBIA1300载体上,进行亚细胞定位实验。结果表明这7个去掉信号肽的CoFLAs均定位在细胞质膜上,而缺少GPI锚定序列的CoFLA1、CoFLA2、CoFLA3、CoFLA5主要定位在细胞质膜外侧。说明油茶CoFLAs蛋白定位在细胞质膜上,而且GPI锚定序列对CoFLAs蛋白在膜上的定位有十分重要的作用。4.油茶CoFLAs基因的原核表达。通过T4连接酶的作用,成功将这7个CoFLAs基因连接到带His标签的pCold-TF载体上,并分别转化至E.coli Rosetta(DE3)菌株中进行原核表达。0.5 mM IPTG可以诱导这7个重组蛋白高效表达。通过Ni2+纯化实验发现,重组蛋白均为可溶性蛋白。将重组蛋白分别添加到水或者花粉培养基中对花粉进行处理,蛋白终浓度均为5 μg/mL。结果显示CoFLA3 对花粉活性有促进作用,CoFLA1、CoFLA2、CoFLA3、CoFLA4 和CoFLA6对花粉萌发有促进作用,CoFLA6对花粉管伸长有显著促进作用。5.油茶CoFLAs基因超表达拟南芥的表型观察。通过T4连接酶的作用,成功构建了这7个基因的超表达载体pCAMBIA1304-CoFLAs。通过花粉管通道法侵染野生型拟南芥,经鉴定这7个基因均筛选到了超表达拟南芥,且每个基因均有3个line收到了 T3代种子。通过观察发现,只有CoFLA2和CoFLA6的超表达拟南芥在角果表型方面与野生型有明显差异,这2个基因的每个line的角果平均长度均比野生型低,将角果长度分段统计之后发现1.0 cm以上角果所占的比例均有不同程度的下降,而小于1.0cm的角果所占的比例均有不同程度的增加,并且不同长度的角果都存在胚珠败育现象。