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研究背景：溶瘤病毒是一类天然存在或经过人工改造后能够选择性感染并裂解肿瘤细胞的病毒，对正常组织细胞影响很小。利用细胞周期相关转录因子E2F-1在多数实体瘤中高表达的特点，设计构建靶向该基因的溶瘤病毒在膀胱癌、胃癌、肝癌等动物模型中得到验证，这也为结直肠癌基因治疗开拓了思路。然而，最早被应用于临床试验的溶瘤病毒ONYX-015的试验结果表明，其作为单一疗法治疗肿瘤抑瘤作用并不明显，需要联合辅助疗法提高抗肿瘤作用。近些年利用细胞过继免疫细胞治疗肿瘤取得长足进展，被视为可与溶瘤病毒结合使用的安全有效的方法。另一方面，研究者在病毒基因组中插入免疫调节基因使得病毒在直接杀伤肿瘤细胞的同时释放免疫调节因子，优化抗肿瘤免疫反应，这成为抗肿瘤“病毒-基因”策略新方向。IL-15作为非常具有潜力的用于肿瘤治疗的细胞因子并未在溶瘤病毒构建中得到充分认识，利用其正向免疫调节作用，同时或序贯给予表达IL-15溶瘤病毒联合过继免疫细胞治疗或可进一步提高抗肿瘤作用。研究目的：研究E2F-1在结直肠癌中表达情况，构建靶向E2F-1基因和同时表达IL-15基因溶瘤腺病毒，探讨新型溶瘤病毒联合过继免疫细胞（CIK、CTL）治疗结直肠癌的可行性和有效性。研究方法：1）利用Western blot方法检测结直肠癌细胞系SW620、SW480、LS174T中E2F-1表达情况；收集28例直肠癌、32例结肠癌、24例胃癌和正常黏膜组织，免疫组化法检测组织中E2F-1表达情况。2）通过质粒重组、病毒包装构建E2F-1启动子溶瘤病毒Ad-E2F，同时表达IL-15基因的Ad-E2F/IL15病毒以及CMV启动子调控下的复制缺陷性腺病毒Ad-EGFP作对照病毒。3）取健康志愿者外周血PBMC，分别扩增培养CIK和CTL细胞，流式细胞术测定细胞表型。4）荧光显微镜观察Ad-EGFP感染细胞的能力；MTT法检测重组腺病毒Ad-E2F感染对细胞增殖的影响；流式细胞术检Ad-EGFP感染对肿瘤细胞周期的影响；乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测Ad-E2F联合CIK细胞的体外杀伤作用；构建裸鼠原位直肠癌动物模型；体内实验观察Ad-E2F联合CIK细胞的抗肿瘤作用。5）MTT法比较Ad-EGFP、Ad-E2F和Ad-E2F/IL15感染对细胞增殖的影响；ELISA检测细胞上清IL-15表达量；利用裸鼠皮下瘤动物模型比较不同腺病毒的体内抗肿瘤作用；小鼠PET扫描观察病毒抗肿瘤作用；LDH法检测Ad-E2F/IL15联合CTL细胞的体外杀伤作用；体内实验观察Ad-E2F/IL15联合CTL的抗肿瘤作用。研究结果：1）Western blot检测结果显示SW620、SW480、LS174T细胞系中E2F-1均阳性表达；直肠癌、结肠癌和胃癌组织中E2F-1基因阳性率分别为67.9%(19/28)、53.1%(17/32)和83.3%(20/24)，均高于正常黏膜组织（p＜0.01）。2）经过多次酶切和PCR鉴定，重组腺病毒Ad-EGFP、Ad-E2F和Ad-E2F/IL15构建成功且达到实验用滴度。3）CIK和CTL细胞表型鉴定符合要求。4）5型腺病毒Ad-EGFP能高效感染肿瘤细胞而对CIK细胞影响较小；Ad-E2F能明显抑制高表达E2F-1基因肿瘤细胞系SW620的增殖，并存在明显的量效关系，而对正常细胞系Wi38和CIK细胞无明显影响；Ad-E2F杀伤肿瘤细胞后，剩余细胞G1期比例减少，S期比例明显增加；Ad-E2F联合CIK细胞较二者单独应用对SW620细胞有更强的杀伤作用（p＜0.01）。成功构建裸鼠原位直肠癌动物模型，成瘤率80%；体内实验显示Ad-E2F局部注射联合CIK细胞尾静脉注射抗肿瘤作用最强，t检验结果显示CIK联合Ad-E2F治疗组与PBS组（p＜0.0001），CIK组（p=0.0002）和Ad-E2F组（p＜0.0001）差异有统计学意义。5）Ad-E2F/IL15也能靶向杀伤肿瘤，同时高效表达IL-15，而对正常细胞系和CTL细胞增殖无明显影响；不同病毒的体内实验比较显示Ad-E2F/IL15治疗组抑瘤作用最强，治疗效果显著优于其他治疗组（PBS&Ad-E2F/IL15, p=0.0002; Ad-EGFP&Ad-E2F/IL15, p=0.0008; Ad-E2F&Ad-E2F/IL15, p=0.0054）；Ad-E2F/IL15联合CTL细胞的体外杀伤作用较单独应用明显提高；体内实验也证实联合Ad-E2F/IL15瘤内注射和CTL静脉注射较之二者单独应用能更显著地抑制肿瘤生长（p＜0.001）。研究结论：1）E2F-1基因在结直肠癌中高表达，可以作为肿瘤基因治疗靶点；2）E2F-1启动子溶瘤病毒能够靶向杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞少有影响；3）5型重组腺病毒对过继免疫细胞感染能力弱，且不影响其增值，二者可以联合应用；4）Ad-E2F联合CIK细胞，Ad-E2F/IL15联合CTL细胞能分别提高抗肿瘤作用。