研究背景随着社会的发展和医疗卫生技术的进步,人类的预期寿命不断延长,人口老龄化已成为必然趋势。预计到2050年,世界上65岁以上人口数将达到15亿,我国老年人口将接近3.8亿,届时我国将步入全球老龄化最严重的国家方阵。衰老（又称老化）是一个无法逆转的自然进程,其本身不是疾病,但会使机体对环境的生理和心理适应能力降低、抵抗力减弱以及对疾病的易感性增加。此外,已有大量研究表明衰老是包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）和术后认知功能障碍（Postoperative cognitive dysfunction,POCD）在内的许多中枢神经系统疾病的独立高危因素,脑老化最重要的特征之一是认知功能减退。我国已将人口老龄化问题列入“健康中国”国家战略。因此,探究衰老的潜在机制,寻求切实有效的预防和干预措施以改善衰老相关认知功能损伤,实现健康老龄化,不仅是生命科学领域的重要科学问题,同时也是具有战略意义的全球化社会问题。人体肠道内生活的微生物数量高达百万亿个,是人体细胞总数的10倍以上,其庞大的基因组百倍于人体基因组。数十万年以来,肠道微生物与人体形成了一个复杂且庞大的共生系统,肠道被称为人体的“第二大脑”,肠道菌群也被称为一个被遗忘的“器官”。大量研究证实,肠道菌群可能通过“微生物-肠-脑”轴调控大脑功能和行为,且有证据支持肠道菌群变化可能与阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症和自闭症等神经和精神疾病的发生有关。然而,肠道菌群变化在衰老相关的认知功能损伤中作用的研究较少,粪菌移植（Fecal microbiota transplantation,FMT）治疗在其中的作用报道较少,有待进一步研究探讨。POCD是一种麻醉和手术后出现的严重中枢神经系统并发症,主要表现为学习记忆功能受损、执行能力减退、精神错乱和焦虑等,且远期有转化为阿尔茨海默病的风险。目前,已有临床研究表明,POCD在老年病人中的发生率较高,临床诊断主要依据学习记忆认知量表进行个体化评估,在动物研究中均以组别为单位进行诊断和评估,而无客观性诊断标志物。鉴于此,在POCD的研究中探索客观诊断标志物,从而进行个体化诊断和治疗是十分必要的。因此,本研究拟探讨快速老化SAMP8小鼠的认知功能以及肠道菌群变化,并通过FMT的手段进一步探究肠道菌群在其中的作用;此外,探究小鼠生理性衰老进程中肠道菌群的变化以及生理性衰老对POCD易感发生率的影响,并探索肠道菌群作为POCD易感小鼠个体化诊断标志物的可能性。研究目的、方法与结果第一部分快速老化SAMP8小鼠认知功能及肠道菌群的变化目的:检测快速老化SAMP8小鼠的认知功能,并探究其肠道菌群的变化。方法:7月龄雄性快速老化SAMP8小鼠和快速老化抵抗SAMR1小鼠,适应一周后,称量体重,随之通过Morris水迷宫行为学检测小鼠空间学习记忆功能。水迷宫行为学检测结束后,收集小鼠粪便进行16S rRNA高通量测序,检测小鼠肠道菌群的丰富度和多样性差异,并筛选差异性表达肠道菌群。结果:小鼠适应一周后,两组小鼠体重的差异无统计学意义。Morris水迷宫行为学检测结果显示,在定位航行实验中,与SAMR1组相比,SAMP8小鼠的逃避潜伏时间延长,逃避潜伏距离增加;在空间探索实验中,与SAMR1组相比,SAMP8小鼠的穿越平台次数减少,靶象限停留时间缩短。16S rRNA测序结果表明,与SAMR1小鼠相比,SAMP8小鼠的Chao 1指数和Shannon指数降低,Simpson指数的差异无统计学意义;用以评估菌群组成差异的指标（主成分分析和主坐标分析）提示,SAMP8小鼠与SAMR1小鼠的肠道菌群组成有差异。在门和属水平统计分析发现,与SAMR1组相比,快速老化SAMP8小鼠的12个肠道细菌的相对丰度降低。第二部分粪菌移植对伪无菌小鼠认知功能及肠道菌群的影响目的:探究FMT是否可通过调控肠道菌群进而改善伪无菌小鼠的认知功能方法:8周龄雄性C57BL/6J小鼠,随机分成4组:CONT组:正常饮水14天后,无菌PBS溶液灌胃14天;Vehicle组:给予14天抗生素“鸡尾酒”（氨苄青霉素、硫酸新霉素和甲硝唑联合使用）构建伪无菌小鼠后,无菌PBS溶液灌胃14天;SAMR1组:给予14天抗生素“鸡尾酒”构建伪无菌小鼠后,通过灌胃的方式移植快速老化抵抗SAMR1小鼠的粪菌;SAMP8组:给予14天抗生素“鸡尾酒”构建伪无菌小鼠后,通过灌胃的方式移植快速老化SAMP8小鼠的粪菌。FMT结束后通过Morris水迷宫行为学检测小鼠空间学习记忆功能,并收集小鼠粪便,进行16S rRNA高通量测序,检测FMT对伪无菌小鼠肠道菌群的影响。结果:在第1,15,28天分别进行称重,4组小鼠体重间的差异无统计学意义。Morris水迷宫行为学检测结果显示,与CONT组相比,Vehicle组小鼠的逃避潜伏时间延长、逃避潜伏距离增加、穿越平台次数减少以及靶象限停留时间缩短;与Vehicle组相比,SAMR1组小鼠的逃避潜伏时间缩短、逃避潜伏距离减少、穿越平台次数增加以及靶象限停留时间延长,而SAMP8组与Vehicle组小鼠间的水迷宫行为学差异无统计学意义。16S rRNA测序结果显示,与CONT组相比,Vehicle组小鼠的肠道菌群Chao 1指数、Observed species 指数、PD whole tree 和 Shannon 指数均降低;与 Vehicle 组相比,SAMR1组小鼠的肠道菌群Chao 1指数、Observed species指数、PD whole tree和Shannon指数均增高,而SAMP8组较Vehicle组小鼠的α多样性指标差异无统计学意义;另外,主坐标分析结果显示,CONT组和SAMR1组小鼠的肠道菌群组成差异较小,而Vehicle组与CONT组以及SAMP8组与SAMR1组小鼠之间的肠道菌群组成差异较大。通过统计分析发现,在门和属水平共有6种肠道细菌的相对丰度变化有显著性,与 CONT 组相比,Vehicle 组小鼠属水平Lachnospiraceae NK4A136、Moryella和Peptococcus的相对丰度降低,而PrevotellaceaeNK3B31的相对丰度升高,粪菌移植对这4种肠道细菌的相对丰度变化无统计学意义;与Vehicle组相比,SAMP8组小鼠的Firmicutes相对丰度降低,Parasutterella相对丰度增高;与Vehicle组相比,SAMR1组小鼠的Parasutterella相对丰度降低,Firmicutes相对丰度变化差异无统计学意义。第三部分不同年龄C57BL/6J小鼠的肠道菌群变化及其在术后认知功能障碍中的作用实验一目的:探究不同年龄C57BL/6J小鼠的肠道菌群变化方法:正常2月龄、9月龄和18月龄雄性C57BL/6J小鼠,分别纳入以下3组:M2组（2月龄组）、M9组（9月龄组）,和M18组（18月龄组）。收集三组小鼠的粪便,通过16S rRNA基因测序技术探究其肠道菌群变化。结果:16S rRNA测序结果显示,2月龄、9月龄和18月龄三组小鼠肠道菌群的Chao 1指数、Shannon指数和Simpson指数的差异均无统计学意义;然而,主成分分析和主坐标分析结果提示,三组小鼠的肠道菌群组成有差异。此外,在门水平,Proteobacteria、Deferribacteres、Spirochaetae、Tenericutes、Actinobacteria 和Saccharibacteria的相对丰度在2月龄、9月龄和18月龄小鼠中随着月龄的增长而增高;而Cvanobacteria的相对丰度随着小鼠月龄的增长而降低。在属水平,三组小鼠中共计有29个菌属的相对丰度变化差异有统计学意义。实验二目的:探究不同年龄C57BL/6J小鼠的POCD易感发生率方法:正常2月龄、9月龄和18月龄雄性C57BL/6J小鼠进行麻醉和手术（胫骨骨折髓内固定术）以构建术后认知功能障碍模型,造模7天后通过旷场实验和Morris水迷宫行为学分别对小鼠运动功能和空间学习记忆功能进行检测,随之对其水迷宫行为学数据进行聚类分析,将小鼠分为3组:POCD组（POCD易感组）,Non-POCD组（POCD非易感组）和Undetermined组（不确定组）。对比POCD易感和非易感小鼠行为学差异以及生理性衰老进程中的小鼠POCD易感发生率差异。结果:旷场实验结果显示,与对应的Control组相比,2月龄、9月龄和18月龄POCD组和Non-POCD组小鼠运动总距离的差异均无统计学意义。水迷宫结果显示,与对应的Control组相比,2月龄、9月龄和18月龄POCD组小鼠的逃避潜伏时间延长、穿越平台次数减少以及靶象限停留时间缩短;与POCD组相比,2月龄、9月龄和18月龄Non-POCD组小鼠的逃避潜伏时间缩短、穿越平台次数增加以及靶象限停留时间延长;Non-POCD组与对应Control组小鼠的逃避潜伏时间、穿越平台次数和靶象限停留时间之间的差异均无统计学意义。聚类分析的结果显示,麻醉手术后2月龄、9月龄和18月龄POCD易感小鼠所占比例分别为31.58%、38.10%和57.45%。实验三目的:探究18月龄POCD易感和非易感小鼠的个体化肠道菌群差异方法:正常18月龄雄性C57BL/6J小鼠进行麻醉和手术以构建术后认知功能障碍模型,术后对其水迷宫行为学数据进行聚类分析,将麻醉和手术后的小鼠分为POCD组和Non-POCD组。然后,通过16S rRNA测序技术检测对比两组小鼠肠道菌群间的差异,并通过ROC曲线评估究肠道菌群在POCD易感小鼠中的个体化诊断效能。结果:16S rRNA基因测序结果显示,与Non-POCD组小鼠相比,POCD组小鼠的Shannon指数降低,Simpson指数增高;PLS-DA分析结果提示,POCD组小鼠与Non-POCD组小鼠的肠道菌群组成有差异。在门、纲、目、科、属、种六个水平进行统计分析发现,与Non-POCD组相比,POCD组小鼠共计有24种肠道细菌的相对丰度变化有统计学差异,其中有10种肠道细菌的相对丰度在POCD组小鼠中增高,有14种肠道细菌的相对丰度在POCD组小鼠中降低。ROC曲线结果显示,Dehalobacteriaceae和Dehalobacterium的曲线下面积等于1,且其敏感性、特异性、阳性预测率、阴性预测率和准确度均为100%。研究结论1.异常肠道菌群变化是快速老化SAMP8小鼠认知功能损伤的可能因素;2.粪菌移植可作为有效干预治疗手段调控肠道菌群的丰富度、多样性及其组成,进而缓解伪无菌小鼠空间学习记忆功能障碍;3.肠道菌群的变化可能参与到C57BL/6J小鼠生理性衰老进程中,且可能在POCD易感小鼠中发挥着重要作用;4.Dehalobacteriaceae和DeDehalobacterium可作为POCD易感小鼠的个体化诊断标志物。