酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides,简称 CPP)是以牛乳酪蛋白为原料,经蛋白酶水解得到的含有磷酸丝氨酰基的肽。在动物小肠内 pH 呈中性到弱碱性的环境中,CPP 能阻止磷酸钙沉淀的产生,从而促进肠内溶解钙的吸收和利用。按照 N/P(摩尔比)的不同,可以将 CPP 分为 3 个等级:N/P(摩尔比)在 24 以上的 CPP 为高 N/P(摩尔比)CPP,N/P(摩尔比)在 15-24 的 CPP 为中 N/P(摩尔比)CPP,N/P(摩尔比)在15 以下的 CPP 为低 N/P(摩尔比)CPP。 本课题的主要目的是研究高 N/P(摩尔比)CPP 的生产工艺。 首先,选择水解酪蛋白的酶以及水解度监测方法,并利用纳滤技术去除酪蛋白水解液中的部分游离氨基酸和短肽。实验结果表明:用 Alcalase 可以使酪蛋白溶液的水解度达到 16%以上。自然水解并用 TNBS(三硝基苯磺酸)法检测酪蛋白水解度可以减少碱的引入,从而大幅度降低 CPP 产品中的灰份含量。在纳滤时采用截留相对分子质量为150D 的纳滤膜可以适当的降低 N/P(摩尔比),改善产品质量,而且 N 的回收率在 80%以上,大部分 P 可以收回。用该工艺制得的 CPP 产品与 DMV 公司 CPP 产品在 CPP 含量(两者都在 20%以上)和灰分含量(5.7%-6.0%)上很接近,N/P(摩尔比)有一定的差别,DMV 公司 CPP 产品的 N/P(摩尔比)为 32.2,而本实验室制备所得 CPP 的N/P(摩尔比)在 24-28 之间,因此,在质量上优于 DMV 公司的 CPP 产品。 对上述工艺得到的 CPP 和其他不同级别的 CPP 促进钙吸收的体外功能性质进行了比较。测定了 CPP 的结合钙量、阻止磷酸钙沉淀的效果以及 CPP 和柠檬酸的协同作用。研究结果表明:(1) CPP 的结合钙量随温度的升高而减小,随 pH 的升高而增加;(2)CPP 阻止磷酸钙沉淀的能力随温度的下降而升高,随钙磷比的增加和 N/P(摩尔比)的升高而下降;(3)CPP 也能阻止亚铁离子在碱性条件下的沉淀;(4)100℃加热半小时不影响 CPP 阻止磷酸钙沉淀的能力;(5)CPP 和柠檬酸之间存在协同作用。 用 Sephadex G-15 柱层析法分析纳滤透过液,结果表明纳滤能滤去部分小分子的短肽和游离氨基酸。纳滤前 CPP 的平均相对分子质量约为 660.76Da,纳滤后 CPP 的平均相对分子质量为 1150.85Da。纳滤后 CPP 的 HPLC 图谱上相对分子质量在 240Da 的峰较纳滤前有大幅度的降低,说明纳滤能滤去相当部分的小分子肽和游离氨基酸。用Sephadex G-25 柱层析对纳滤后 CPP 进行初步的分离纯化,结果表明有活性 CPP 的相对分子质量较大。 用乙醇提取工艺生产中 N/P(摩尔比)CPP。乙醇提取工艺所得 CPP 的 N/P(摩尔比)在 19-24 之间,确定了提取法所用乙醇浓度为 85%,提取所用乙醇体积与提取前CPP 的质量比(v/g)为 10:1,提取后 CPP 的 N 得率为 74.55%,P 得率为 98.37%。提取后 CPP 产品的灰份含量较低,为 6.79%。乙醇提取工艺可以应用于中 N/P(摩尔比)CPP 的工业化生产。另外,用乙醇提取法能得到灰份含量很低的 NPP 产品(4.42%)。