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论文一:RNA解旋酶DDX5通过抑制mRNA降解参与氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的巨噬细胞清道夫受体1(MSR1)的表达研究背景和目的:动脉粥样硬化的标志性特征是单核细胞源性巨噬细胞进入血管内皮后吞噬脂质变成泡沫细胞。在斑块形成的最初阶段,巨噬细胞的吞噬作用有助于消除血管壁内的氧化低密度脂蛋白和凋亡细胞,但是在后期阶段巨噬细胞形成泡沫细胞,斑块增长、破裂,最终引起血栓形成。由此可见,研究分析巨噬细胞脂质吞噬过程是非常必要的。DDX5(the DEAD box protein 5)是ATP依赖的RNA解旋酶,通过调控转录在多种实体肿瘤性疾病中都发挥了重要调节作用。但是关于DDX5在心血管疾病中的作用知之甚少,所以这里我们主要探究DDX5是否参与巨噬细胞脂质吞噬过程,以及它调控这一过程的具体机制。研究方法:本研究中,我们首先通过对巨噬细胞给予时间梯度和浓度梯度的oxLDL刺激,检测DDX5总体表达情况的变化,观察DDX5在胞浆和胞核中的分布是否具有差异。其次,通过构建siRNA抑制巨噬细胞内DDX5的表达,研究DDX5对于巨噬细胞脂质吞噬的影响,探究其潜在的作用机制,即DDX5是否是通过调节与脂质吞噬相关的受体表达发挥作用的。最后,通过双荧光素酶报告基因法,质谱分析,蛋白质免疫共沉淀和RNA-蛋白质免疫共沉淀法,探究DDX5影响吞噬受体表达的具体机制。结果:对巨噬细胞给予oxLDL刺激以后,随着oxLDL作用时间的延长和作用浓度的增加,巨噬细胞内DDX5在mRNA水平和蛋白水平表达均逐渐升高,且oxLDL对DDX5表达的促进作用并不依赖于MAPK和NF-κB信号通路。通过小干扰RNA对DDX5表达抑制以后,巨噬细胞脂质吞噬功能明显下降,且这种下降与DDX5影响巨噬细胞表面清道夫受体1(MSR1)的表达相关。通过双荧光素酶报告基因法,发现DDX5促进MSR1表达并不是通过增强其转录活性实现的,而是通过抑制MSR1mRNA降解实现的。通过质谱分析法,发现DDX5和METTL3蛋白之间存在相互作用,且后者会降低MSRI表达。最终通过RNA-蛋白免疫共沉淀法,我们了解到,METTL3结合于MSR1mRNA上促进其m6A甲基化的发生,从而促进MSR1mRNA降解。而DDX5通过与METTL3结合,部分抑制了后者与MSR1mRNA的结合,从而抑制MSR1mRNA的m6A甲基化和降解。结论:DDX5参与巨噬细胞脂质吞噬的调节。首先巨噬细胞脂质吞噬时,会引起DDX5表达上升,而上升后的DDX5通过与METTL3蛋白结合,抑制后者对MSR1mRNA的m6A甲基化的诱导,减少MSR1mRNA的降解,从而促进MSR1表达增加,有助于巨噬细胞脂质吞噬功能的提升。因此,DDX5可以作为动脉粥样硬化预防和治疗的新靶点。论文二:慢病毒介导的CD97/ADGRE5蛋白过表达可以逆转高糖诱导的内皮细胞迁移受损中文摘要研究背景和目的:糖尿病作为一种代谢性全身性疾病,严重威胁着人类的健康。其中,多种糖尿病血管并发症都与内皮功能受损相关,包括视网膜血管病变所致的视力缺失,慢性迁延不愈的溃疡,以及糖尿病所致的心脑血管病变等。糖尿病所致的内皮功能受损包括内皮细胞收缩和舒张异常,迁移和粘附失调等。分化抗原簇(CD)97/粘附G蛋白藕联受体5(ADGRE5)是G蛋白藕联受体家族的成员,在多种细胞表面表达,其中包括造血细胞,上皮细胞和肌细胞等,也参与多种生理发育过程和肿瘤迁移增殖过程。所以这里,我们提出假设:是否CD97参与糖尿病所致的内皮迁移功能受损。研究方法:为了研究CD97在糖尿病内皮迁移受损中的作用,我们首先检测了在高糖状态下人脐静脉内皮细胞系(HUVECs)和糖尿病小鼠主动脉内皮中CD97的表达情况;然后运用慢病毒载体构建CD97的过表达内皮细胞系,观察不同处理组之间划痕实验的情况;通过短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR-相关蛋白9(Cas9)构建CD97敲除内皮细胞系,与CD97过表达细胞系一起,检测与细胞迁移相关的各种因子的表达变化。另外,通过细胞骨架染色,我们研究CD97对细胞骨架的影响。最后,通过双荧光素酶报告基因法和ChIP法研究高糖影响CD97表达的潜在机制。结果:(1)在高糖诱导的HUVECs和糖尿病小鼠主动脉内皮中,CD97/ADGRE5的表达明显减少;(2)在HUVECs中过表达CD97(EGF1,2,5)可以缓解高糖所诱导的HUVECs迁移功能失调;(3)以一种CDC42-ARP2依赖的途径,CD97促进内皮细胞中肌动蛋白富集和重组;(4)高糖状态通过调节STAT1抑制CD97的转录。结论:本文发现在糖尿病小鼠及高糖处理过的人脐静脉内皮细胞中,存在着CD97表达受到抑制的现象和内皮迁移受损的现象。而且,在HUVECs中过表达CD97后可以有效缓解内皮迁移受损,且这一过程与CDC42-ARP2依赖的途径相关,即通过该途径,CD97促进内皮细胞中肌动蛋白富集和重组,从而改善内皮的迁移功能。最后我们还发现高糖对CD97表达的抑制作用是通过调节转录因子STAT1完成的。