第一部分P53、C-myc基因产物在小细胞肺癌中表达与临床意义　　 近年来，随着分子生物学的发展及其技术的广泛应用，人类尝试将肺癌的诊断和治疗建立在分子生物学基础上。对癌基因和抑癌基因的深入研究是揭示致癌机制、开展新的基因诊断、基因治疗以及研制新的抗肿瘤药物的必由之路。自从1910年Rows在鸡肉瘤中发现肉瘤病毒以来，对癌基因的研究已有90多年的历史。人们已发现了100多个癌基因与数十个抑癌基因。随着人类基因组计划的完成将有更多的基因及其功能被发现。 P53基因虽发现于1979年，但直到1989年才认识到它是典型的抑癌基因。 P53基因在多种肿瘤中普遍失活，突变的发生遍布整个基因，包括点突变，缺失和过表达。小细胞肺癌的突变率可达80％。但有关突变和过表达的生物学行为与临床后果的关系说法不一。　　 C-myc是原癌基因myc家族中的一员，国外研究小细胞肺癌中约有30％～50％的细胞系和11％～24％的肿瘤存在C-myc基因扩增，有89％的细胞系和83％的肿瘤存在过表达。并且C-myc扩增还可导致小细胞肺癌形态学改变、体外生长迅速，使患者发生放射耐受及生存期缩短。国内有关C-myc基因与小细胞肺癌的关系报道不多，特别是研究P53，C-myc基因产物在小细胞肺癌中共同表达的研究则更少。本研究利用免疫组织化学方法研究P53、C-myc基因在小细胞肺癌中的表达，探讨它们与临床分期、淋巴结转移及预后的关系。　　 实验材料：　　 本组收集1986年8月～2000年2月间中国医科大学第一临床学院胸外科手术切除的原发小细胞肺癌组织标本36例。所有病例术前均未接受化疗和放疗，术后均经病理证实。其中男性21例，女性15例。平均年龄54.3岁。分期标准为国际抗癌联盟(UICC)1997年10月新修订的肺癌分期标准。其中Ⅰ期5例，Ⅱ期14例，Ⅲ期17例；有淋巴结转移31例；25例病人得到随访结果，术后生存时间超过18个月16例，不足18个月9例。　　 染色结果判定：　　 按文献标准：P53以细胞核呈清晰棕黄色为阳性，C-myc以细胞核或细胞浆呈清晰棕黄色为阳性。无明显阳性细胞，+阳性细胞数占25％以下，++阳性细胞数占25％～50％，+++阳性细胞数占50％以上。　　 统计和分析方法：　　 以x2检验测定P53、C-myc蛋白表达与TNM分期、有无淋巴结转移、预后的关系。采用SPSS9.0统计软件包处理，分别设定P＜0.05和P＜0.01为差异有显著性和非常显著性。　　 结论：　　 1.P53蛋白在小细胞肺癌组织中有较高的表达，表达率随PTNM分期增加而升高。有淋巴结转移者比无淋巴结转移者表达率高。　　 2.P53蛋白表达越高预后越差。　　 3.C-myc基因产物在小细胞肺癌有较高的表达，随分期增加、淋巴结转移的出现表达有增高趋势。　　 4.C-myc蛋白表达越高预后越差。　　 5.53和C-myc蛋白共表达的小细胞肺癌患者预后不佳。　　 第二部分小细胞肺癌新的相关基因cDNA片段的克隆与鉴定　　 肺癌是当前世界各国常见的恶性肿瘤之一，并已成为人类因癌症而死亡的主要原因，被认为是当今世界上对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤。从全球范围看，近半个世纪以来肺癌的发病率在不断地增长，尤其是在工业发达国家更加突出。在第五届瑞士国际肺癌大会上指出“21世纪最常见的疾病有可能是肺癌和爱滋病。”中国预防医学科学院卫生信息公布：在今后30年中，肺癌将成为中国居民的主要死因。　　 1971年Knudson提出的二次突变假说是一个为肿瘤遗传学研究工作者所普遍接受的有关肿瘤发生机理的科学预言，指导了二十几年来肿瘤分子机制的研究。包括肿瘤在内的疾病致病基因的克隆和定位是人类基因组计划的一项重要内容。所以，我国根据自己的遗传学发展状况和病源优势，紧紧围绕基因组计划，积极开展致病基因的克隆和定位工作，其中，肿瘤相关基因的克隆、定位是肿瘤分子遗传学研究的热点之一。目前对肺癌，尤其是小细癌的发生机制仍然不十分清楚，涉及许多遗传损伤，包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活等许多相关基因的突变，这些基因参与肿瘤的启动、促进、发展及转移等各个阶段。　　 mRNA-差异显示(mRNA-differential display，mRNA-DD)方法是90年代发明的分离、克隆基因的先进技术。这一技术一经问世立即受到分子生物学研究学者的欢迎，经过不断改进，这一技术日趋成熟。应用该技术已成功发现并鉴定了一些肿瘤相关基因。但有关该技术在肺癌，尤其在小细胞肺癌领域研究的报道罕见，特别是用新鲜组织标本为研究材料国内尚无报道。本研究采用mRNA-差异显示方法尝试克隆并鉴定小细胞肺癌新的相关基因cDNA片段，将为肺癌发生的分子机制基因诊断和治疗的研究提供新的靶基因奠定基础。　　 实验材料：　　 1.标本：来源于中国医科大学第一附属医院胸外科一患者的手术切除标本，切取癌组织与癌旁5cm正常肺组织各0.5cm3置-70℃深冻冰箱中保存，切取癌组织经病理确证为小细胞肺癌、癌旁组织中不含癌组织。　　 2.引物：分为锚定引物T12C和随机引物AP-A5。　　 3.主要试剂：(1)RNA提取试剂TRIZOL Reagent、总RNA分离试剂；(2)逆转录试剂；(3)PCR试剂；(4)载体连接系统pGEM-T Easy vector systerm；(5)JM109高转化细胞；(6)质粒筛选试剂IPTG X-gal；(7)内切酶PstI NcoI；(8)质粒抽提纯化试剂盒。　　 4.主要仪器设备：Heidolph DIAX600匀浆器、各型PCR仪、HERMLEZ323K台式低温超速离心机、GDS8000凝胶自动成像仪、各种电泳仪、RCR设计软件OUIGO。　　 实验方法：　　 1.总RNA提取：取癌组织与癌旁组织用锡箔纸分别包裹后液氮冷冻10分钟，锤击粉碎加入TRIZOL试剂，匀浆器匀浆，经氯仿抽取离心，加入异丙醇混匀离心，弃上清，乙醇漂洗备用。　　 2.cDNA第一链合成：(1)Dnase I消化(2)逆转录合成cDNA第一链(3)Rnase H消化RNA(4)cDNA扩增PCR反应条件：94℃变性3分钟，以94℃35秒、36℃1分30秒，72℃35秒的顺序循环32次，最后72℃延伸7分钟。　　 3.PCR扩增产物的检测：取PCR扩增产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒定电流40mA，电泳约3小时直至指示剂二甲苯蓝接近胶底部，取下凝胶并在SYBR Green I(3/10000)染料中染色半小时左右后，送GDS8000凝胶自动成像仪进行图像分析。　　 4.差异片段的纯化　　 借助凝胶自动成像仪寻找差异片段，并将其切下，捣碎离心后取上清再用相同的引物和RCR条件重新进行扩增，取再扩增产物进行1.2％低熔琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下用无菌刀片快速切取扩增产物条带。70℃孵育至胶完全熔化，注入纯化柱。经纯化处理收集到的液体即为纯化的DNA溶液，置-20℃保存。　　 5.差异cDNA片段的克隆：(1)连接：将纯化PCR产物在T4DNA连接酶作用下与PGEM-T载体反应，4℃过夜置-20℃冰箱中保存。(2)转化：将连接反应产物中加入JM109感受态细胞，加入LB培养基，离心、弃上清，接种于含氨苄霉素IPTG和X-gal的琼脂培养基平皿中，37℃过夜。(3)阳性克隆的筛选：pEGM-T质粒具有β-半乳糖苷酶筛选系统，它携带一段细菌的LacZ基因-α肽基因，外源基因的插入使该基因失活，使其编码的β-半乳糖苷酶的一段α一肽失去功能，不能将生色底物X-gal催化，所以含重组质粒的细菌将形成白色菌落，而非重组质粒因具有α-肽活性，能使生色底物产生蓝色，形成蓝色菌落，若阳性对照(白色菌落)和阴性对照均正确，而插入目的cDNA的转化子在上述培养皿上面既存在蓝色又存在白色菌落的情况下，白色菌落即为阳性克隆。(4)质粒DNA的提取与纯化：用质粒快速抽提纯化试剂盒操作。(5)阳性克隆的鉴定：用酶切反应进行阳性克隆的鉴定。　　 6.插入子序列测定：委托上海基康生物公司进行测序。　　 7.差异cDNA片段的验证：根据三个cDNA片段测序结果分别设计三对特异引物，以相同肺癌患者的总RNA为模板，进行RT-PCR反应。　　 8.同源性比较与分析：将测序结果输入微机，在国际互联网上应用Blast Similarity Searching系统进行同源性比较和分析。　　 结论：　　 1.相关肺癌癌基因与抑癌基因克隆定位及功能研究能为肿瘤的基因治疗提供靶基因。　　 2.mRNA差异显示技术是研究基因差异表达的先进方法，具有快速、灵敏、高效的特点。　　 3.本研究克隆的三个cDNA片段为新的小细胞肺癌候选基因片段。