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背景和目的血管性痴呆（Vascular dementia，VaD）是由各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征。其主要临床表现包括认知能力、记忆力和社会生活能力的减退及情感性格的改变，至今对其仍无有效的防治措施。随着对VaD的深入研究，很多学者认为，N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体与VaD患者认知功能障碍有关。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体是由亚单位组成的异五聚体，不同的亚单位组成的受体往往表现出不同的生理学和药理学特性。分布在海马的NMDA受体亚单位主要是NR1、NR2B。NR1亚单位是NMDA受体的功能单位，是Ca2+通道的主要调节者，Ca2+含量的增加是激活内源性核酸内切酶而降解DNA的先决条件，是细胞凋亡的启动因素。NR2B是NMDA受体的2型亚单位，在突触可塑性和学习记忆中扮演重要的角色。VaD患者体内脂质过氧化物反应增强，产生大量的过氧化氢自由基，过氧化氢对生物体细胞具有毒性作用，而谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、过氧化氢酶（CAT）是机体内广泛存在的两种催化过氧化氢分解的酶，是体内重要的自由基清除剂，对清除自由基和防止脂质过氧化发挥着重要作用。盐酸多奈哌齐（donepezil）是近年来用于治疗血管性痴呆病的胆碱酯酶抑制剂，而有关其对VaD是否具有脑保护等其他作用机制，目前国内外报道甚少。本实验通过建立拟VaD模型，采用对照研究的方法观察海马CA1区神经细胞形态学变化及NR1、NR2B的免疫组织化学表达变化和对GSH-PX、CAT活力的影响，探讨盐酸多奈哌齐在VaD治疗中是否存在其它作用机制，为其在VaD临床应用中提供更完善的理论依据。材料与方法1．模型制备采用双侧颈总动脉（CCA）夹闭缺血再灌注法制备模型。模型组和多奈哌齐组腹腔注射硝普钠（2.5mg／kg，用无菌蒸馏水溶解），用无创动脉夹夹闭双侧CCA、再通、再夹闭各10 min后再通，缝合伤口。假手术组不阻断CCA，不注射硝普钠，余操作过程相同。2．动物及分组健康成熟雄性SD大鼠48只（购自郑州大学实验动物中心），重量（400±50）g，随机分为A、B、C三组，A组：假手术组，即正常对照组；B组：模型组和C组：多奈哌齐组，每组16只。多奈哌齐组在造模大鼠完全清醒8h后，给予多奈哌齐1mg／kg（溶解于生理盐水中）灌胃，每日1次，共30d；假手术组和模型组给予等量生理盐水，共30d。3．指标观测（1）学习、记忆能力检测造模后分别于第7d、第25d，用Y-型迷宫实验测试全天总反应时间（TRT）和大鼠每天出现错误反应的次数（EN），以EN≤2次，TRT≤120s作为判定大鼠学习记忆的标准。（2）GSH-PX、CAT活力测定造模后第30天，各组选8只大鼠麻醉后断头，冰盘上取脑，小心剥离海马，按标本重量用生理盐水配成10％的脑匀浆，低温高速离心3500r／min，离心10min，取上清液，分别采用5 5’二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）法及紫外分光光度法测定其活力并与对照组比较。（3）病理学检测HE染色：光学显微镜下观察大鼠海马CA1区神经元病理变化Nissl染色：甲苯胺蓝染色法染色，光学显微镜下及油镜下观察大鼠海马CA1区神经元胞浆尼氏体变化。（4）NR1、NR2B的免疫组织化学染色：NR1、NR2B阳性细胞胞膜及胞浆被染成棕黄色，以胞膜最明显。各切片在海马CA1区随机选取8个视野，检测面积大致相同，采集8组数据，取其平均值作为该切片目标区域的平均灰度值，每组切片依次完成检测，计算该组切片被检区域灰度值的平均值。4．统计方法实验数据用均数±标准差（（?）±s）表示，采用单因素方差分析法，使用SPSS11.0统计软件，以α=0.05作为检验水准，以α=0.01作为显著性检验水准，用S-N-K法和LSD法进行各组间的两两比较。结果1．学习、记忆能力的比较第7d测EN及TRT发现：A组的学习和记忆成绩明显高于B组和C组（P＜0.01），C组与B组相比，C组学习和记忆成绩较好（P＜0.05），提示造模成功。第25d测EN及TRT发现：B组的学习和记忆成绩显著低于A组和C组（P＜0.01），而后两组间的成绩则无明显差异（P＞0.05），提示盐酸多奈哌齐治疗效果显著。2．GSH-PX活力A组为98.67±13.85，B组为57.35±14.84，C组为82.81±9.14。C组与B组相比有明显差异（P＜0.05），C组与A组相比差异不明显（P＞0.05）。3．CAT活力A组为31.91±6.54，B组为14.32±3.87，C组为28.19±6.32。C组与B组相比有明显差异（P＜0.05），C组与A组相比差异不明显（P＞0.05）。4．病理学改变HE染色（×400） A组：大鼠海马CA1区神经细胞层次清、数目多，排列紧密、胞核呈圆形或椭圆形；B组：神经细胞结构松散、数目减少、排列紊乱，胞核深染、固缩，核仁消失，胞浆周围空晕，胞间距较大，大量不规则形胶质细胞及散在胶质细胞增生小结，仅见少量正常神经细胞；C组：明显优于模型组，正常神经细胞数目较多，排列较密，胞核圆或椭圆形，少见固缩变性的神经元。Nissl染色（×400） A组：神经元清晰可见，细胞结构完整，胞浆淡染，神经突起完整。油镜下斑片状丰富的尼氏体，核仁清晰可见，胞核与胞浆清晰可辨；B组：神经元皱缩变形、胞浆深染，油镜下尼氏体减少或丢失、胞核与胞浆分界不清C组：清晰淡染的神经元，有较多完整的神经元突起，油镜下点片状较为丰富的尼氏体，胞浆与胞核之间清晰易辨。5．NR1、NR2B免疫组织化学的表达5．1．各组NR1分布（SP×400） A组：海马CA1区层次清，排列紧密，NR1阳性神经元胞膜呈黄色，胞浆较淡，胞体大圆或椭圆形；B组：层次减少，排列疏松，但残余的NR1阳性的神经元胞膜着色明显加重，呈深棕黄色，并可见胞核着色；C组：神经元数目明显增多，排列较密，但NR1阳性神经元明显减少且染色淡黄，只见到部分神经元着色。5．2．各组NR2B分布（SP×400） A组：海马CA1区层次清，排列紧密，大量的NR2B阳性神经元，染色深呈棕黄色，胞膜着色最深，胞浆稍淡，可见黄染的突起；B组：层次不清，排列紊乱，可见散在染色较淡的阳性神经元；与B组相比，C组的阳性神经元数目明显增多，层次清，排列较密，染色也明显变深。5．3．各组NR1阳性神经元免疫反应灰度值比较结果显示：C组与A组间比较无差异，但B组显著高于此两组（P＜0.01）。5．4．各组NR2B阳性神经元免疫反应灰度值比较结果显示：C组与A组间比较无差异，但此两组显著高于B组（P＜0.01）。结论1海马CA1区NR1表达的增高和NR2B的减少及GSH-PX、CAT活力的降低与VaD有关；2盐酸多奈哌齐对拟VaD大鼠海马神经元有保护作用，其机制可能是通过降低NR1的表达，提高GSH-PX、CAT的活性来减轻神经元损伤；3盐酸多奈哌齐不仅可以通过促进脑部乙酰胆碱的功能来改善认知障碍，且也可能通过降低NR1的表达，保护海马神经元免受损伤，改善形态学结构来提高NR2B的表达，从而改善拟血管性痴呆大鼠的学习、记忆。