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目的:tet(A)基因变异体能够介导替加环素低水平耐药。本研究通过对河南地区产KPC-2酶肺炎克雷伯菌携带tet(A)基因变异体的发生率、水平传播机制以及分子流行病学特征进行研究,为控制tet(A)基因变异体的进一步播散和临床有效治疗替加环素不敏感的产KPC-2酶肺炎克雷伯菌提供理论基础。方法:(1)以2013年11月-2018年11月收集郑州大学某教学医院的459株非重复耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)为研究对象,根据VITEK(?)2药敏初筛结果,针对替加环素MIC≥0.5μg/mL的菌株进行碳青霉烯酶基因和tet(A)基因变异体的检测。(2)筛选tet(A)基因阳性且产KPC-2酶的CRKP,对其携带的tet(A)基因全长序列进行测序并分析氨基酸差异,通过酶切克隆验证tet(A)基因变异体介导替加环素耐药表型的功能。(3)通过微量肉汤稀释法和琼脂稀释法测定目标菌株对临床常用抗菌药物MIC值;利用PCR筛查目标菌株携带的其他耐药基因。(4)利用多位点序列分型对目标菌株进行同源性分析。(5)通过S1-PFGE和Southern杂交对tet(A)基因变异体和blaKPC-2基因进行定位分析;采用全质粒测序分析代表性tet(A)质粒的序列特征并探讨tet(A)基因变异体水平传播的分子机制。结果:(1)89株产KPC-2酶CRKP携带tet(A)基因变异体,其中84株CRKP携带Type 1型tet(A)基因变异体,占比94.38%,另外5株CRKP携带两种新型的tet(A)基因变异体,酶切克隆实验结果显示新型tet(A)基因变异体能介导替加环素的药敏值升高2-4倍;从发生率来看,自2013年的21.73%到2018年43.44%,tet(A)基因变异体的阳性检出率呈上升趋势,导致替加环素的耐药水平从10.35%上升到18.62%。(2)携带tet(A)基因变异体产KPC-2酶CRKP感染患者集中分布在ICU,占比60%;患者年龄主要集中在41-80岁之间,性别以男性为主;标本来源以痰液为主,占比45%;tet(A)基因变异体阳性菌株对临床常用的大部分抗菌药物耐药,仅对多粘菌素E敏感性较高;MLST分型以国内流行的ST11型为主,占比83%。(3)S1-PFGE和Southern杂交结果显示tet(A)基因变异体主要定位于质粒,大小主要分布在61-100 kb之间。5个不相容性类型和大小不同的代表性tet(A)质粒(pKP14-46-tet(A)、pKP16-19-tet(A)、pKP13-53-tet(A)、pKP18-50-tet(A)和pKP15-2-53-tet(A))的全质粒测序结果显示:tet(A)基因变异体遗传背景各不相同,但都具有Tn1721转座子的保守结构(tetR-tet(A)-pecM),我们推测tet(A)基因变异体在CRKP中的流行可能最初来源于Tn1721转座子结构,后来在传播过程中发生了重组进化。结论:1、本研究显示tet(A)基因变异体在河南地区分离产KPC-2酶CRKP中的发生率较2013年明显升高,导致替加环素的耐药水平升高;2、流行克隆ST11型和可移动遗传元件(质粒或转座子Tn1721)是介导tet(A)基因变异体播散的主要载体;发现了同时携带tet(A)基因变异体和blaKPC-2基因的质粒,在碳青霉烯类抗生素筛选压力下可能会促进tet(A)基因变异体的播散。