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目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种病变主体在肝小叶,以肝细胞脂肪变性和脂质沉积为病理特征,但无过量饮酒史的临床综合征,疾病谱包括单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。研究报道2型糖尿病(T2DM)患者中NAFLD的发病率高达55.5%,约为普通人群的2倍,NASH的发病率高达37.3%,比普通人群高2倍以上。但由于NASH的发病机制复杂、尚未完全阐明,目前缺乏针对性的有效治疗药物。钠-葡萄糖共转运体2(SGLT2)抑制剂是一种新型的抗糖尿病药物,临床和实验研究表明SGLT2抑制剂除了有降糖作用外,还可减少肝脏脂质含量,但其具体机制尚不清楚。因此本研究以T2DM合并NASH和T2DM不合并脂肪肝患者为研究对象,通过i TRAQ蛋白质谱检测筛选差异显著且与脂质代谢相关的蛋白并预测其相关信号通路。然后在体内外进一步验证并探讨恩格列净对AMPK/FOXA2/MCAD通路及肝脏脂质代谢的作用。方法:选取T2DM合并NASH患者和T2DM不合并脂肪肝患者各6例,在进行肝血管瘤或胆囊息肉等良性病变手术切除时获取肝脏组织标本用于i TRAQ蛋白质谱检测及后续的免疫组化、蛋白印迹、q RT-PCR检测。选取8周龄雄性db/m小鼠作为正常对照组。8周龄db/db小鼠作为实验组,并随机分成两组:安慰剂干预组、恩格列净治疗组。对照组小鼠正常饮食8周,实验组小鼠高脂饮食8周,药物干预8周,干预期间每两周定时检测小鼠体重及血糖。在第8周末时用水合氯醛对小鼠进行麻醉,眼球取血用于检测血脂水平,取肝脏组织用于检测肝脏脂质水平及肝脏中MCAD、FOXA2、p-AMPK及IL-1β、TNFα等蛋白的表达水平。以正常肝细胞为对照组,脂肪变肝细胞为实验组,在恩格列净、AMPK激活剂、AMPK抑制剂及si RNA-FOXA2干预结束后检测p-AMPK、FOXA2及MCAD等蛋白表达水平。结果:1.人肝脏组织i TRAQ蛋白质谱及免疫组化、蛋白印迹、q RT-PCR结果显示:与对照组相比,T2DM合并NASH组患者肝脏中p-AMPK、细胞核FOXA2及MCAD蛋白水平明显降低,IL-1β、TNFα蛋白水平明显升高。2.小鼠一般资料结果显示:与正常组相比,db/db组小鼠体重、血糖、血脂及肝脏脂质水平明显升高,而恩格列净干预后,体重、血糖、血脂及肝脏脂质水平均明显降低。油红染色结果显示:与正常组相比,db/db组小鼠肝脏脂质沉积明显增加,而恩格列净干预后,肝脏脂质沉积明显减少。免疫荧光及Western blot结果显示:与正常组相比,db/db组小鼠肝脏中p-AMPK、细胞核FOXA2及MCAD蛋白水平明显降低,IL-1β、TNFα蛋白水平明显升高,而恩格列净干预后,肝脏中p-AMPK、细胞核FOXA2及MCAD蛋白水平明显升高,IL-1β、TNFα蛋白水平明显降低。3.细胞油红结果显示:与对照组相比,高糖高脂组细胞中脂质沉积明显增加,而恩格列净干预后,细胞中脂质沉积明显减少。免疫荧光及Western blot结果显示:与正常组相比,高糖高脂组细胞中p-AMPK、细胞核FOXA2及MCAD蛋白水平明显降低,而恩格列净干预后,肝脏中p-AMPK、细胞核FOXA2及MCAD蛋白水平明显升高。Western blot结果显示:与恩格列净组相比,AMPK激活剂干预组细胞中p-AMPK、细胞核FOXA2及MCAD蛋白水平没有明显变化,而AMPK抑制剂干预组细胞中p-AMPK、细胞核FOXA2及MCAD蛋白水平明显减少。Western blot结果显示:与恩格列净组相比,si RNA-FOXA2干预组细胞中p-AMPK、总FOXA2及MCAD蛋白水平明显减少;而si RNA-FOXA2加恩格列净共同干预后,细胞中p-AMPK蛋白水平明显增加,但总FOXA2及MCAD蛋白水平没有明显变化。结论:1.在T2DM合并NASH患者肝脏中AMPK/FOXA2/MCAD通路明显受损。2.恩格列净通过激活AMPK/FOXA2/MCAD通路促进肝脏脂肪酸氧化,减少脂质沉积和炎症反应,从而改善NASH。