论文部分内容阅读
将实验室保存的LG1株H9N2亚型禽流感病毒在SPF鸡胚中传代，对其神经氨酸（NA）基因和血凝素(HA)基因分别进行扩增、克隆，然后进行阳性克隆鉴定。序列测定表明，所扩增的NA基因全长1401bp,编码466个氨基酸；所扩增的HA基因全长1683bp，编码560个氨基酸。第一个循环的传代，起始病毒为LG1株。SPF来源的白来航鸡在开产前用LG1株H9N2亚型禽流感病毒制备的灭活油乳疫苗免疫接种二次，使其血清中对H9的血凝抑制抗体效价达到29。开产后收集受精蛋孵化，作为有H9母源抗体的鸡胚；同时将同品系的SPF鸡场取得的种蛋孵化，作为无H9母源抗体的鸡胚。有抗体组分为A1-4四个独立的传代系列，无抗体组分为B1-2两个独立的传代系列。有抗体组和无抗体组分别连续传代40代，由本实验室保存，用于NA基因的扩增克隆测序，并与原始病毒比较。为了实施第二轮传代试验，从第一轮试验的有抗体组第40代中选择已发生明显稳定变异的变异株病毒A1-40和A3-40作为起始病毒并制作油乳苗进行分别免疫，免疫方法同第一个循环。有抗体组分别为A1-40-A和A3-40-A，对应的无抗体组为A1-40-B和A3-40-B。对每个传代系列的10，20，30，40代病毒的NA基因和HA基因分别进行扩增克隆测序，并分别与起始病毒的序列比较。结果显示LG1株H9N2亚型禽流感病毒在有抗体的SPF鸡胚的传代过程中，有3个系列从10～20代起在NA基因的#99位发生了可稳定遗传的碱基“G”到“A”的突变，并使氨基酸由蛋氨酸变为异亮氨酸；有2个系列从20～30代起在#473位发生了可稳定遗传的由“A”到“G”的碱基突变，导致相应的氨基酸由天冬酰胺变为丝氨酸，另一个传代系列在第二循环的第10代时也发生了同样的突变。在无抗体的鸡胚上的2个独立对照系列同样传了两个循环，在这2个位点没有发生突变，表明这2个突变与抗体的选择压相关。第一循环在抗LG1母源抗体阳性鸡胚的连续40代传代过程中，NA基因在有抗体组的四个传代系列碱基的非同义突变（NS）与同义突变（S）比为4.6(32/7),而在无抗体组NS/S比为2.0（16/8）。有抗体组NS/S值显著高于无抗体组，也显示出抗体的选择压作用。在第二循环中HA未形成新的稳定的突变。本实验结果证明在鸡胚传代过程中，母源抗体提供的免疫选择压确实能影响H9N2的NA基因的变异，但是对NA基因的影响小于HA基因。同时表明，带有母源抗体的鸡胚是实验室条件下研究抗体免疫选择压对病毒抗原性变异影响的一种有效并简单可行的实验模型。