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流感病毒各基因片段末端的包装信号对于病毒RNA有效地包装到病毒粒子中起着非常重要的作用,而包装信号之间的序列也与能否成功包装入具有复制能力的病毒粒子密切相关。本研究在PR8毒株反向遗传操作系统的基础上,将不同核苷酸序列插入到HA包装信号之间,进行病毒拯救,研究影响病毒基因包装的必须条件,并对表达外源基因重组病毒的生物学特性进行了研究。为了构建表达外源基因的流感病毒,首先将PR8病毒HA基因的包装信号序列插入到PolI启动子和终止子之间,然后在包装信号之间分别插入海肾荧光素酶基因(Renilla luciferase)、鸭坦布苏病毒(DTMUV) E基因或密码子优化后的E基因、E基因结构域Ⅲ (EDⅢ)序列或密码子优化后的EDin序列、H9N2亚型禽流感病毒SH441的HA基因或密码子优化后的HA基因,利用PR8流感病毒反向遗传操作系统拯救病毒。结果显示：插入Renilla、EDⅢ和SH441HA基因的重组病毒可以拯救成功,通过RT-PCR方法证明外源基因存在于重组病毒中。而其它几株重组病毒拯救不成功,没有检测到特异性的插入序列。利用mfold软件分析这几种插入基因的RNA二级结构,发现插入这些序列后,R.NA二级结构均保留了流感病毒特有的的3’和5’结构,3种可以救获病毒的插入片段也没有特异的二级结构特征；比较GC含量发现,插入外源基因的自由能(dG)可能是影响其是否能被包装到具有复制能力病毒粒子中的重要因素。为研究重组病毒中外源基因能否稳定表达,将表达外源EDIII肽段的重组HA-EDIII-HA病毒感染MDCK-HA2细胞进行传代后,用100μl103TCID50感染细胞后,60h后血凝价达到最高为25,48h病毒滴度最高达到105.0TCID50/100μl。通过激光共聚焦和Western Blot方法,发现在HA-EDⅢ-HA病毒感染细胞中,可同时在胞质检测到NP蛋白和EDIII蛋白的表达。为研究含有外源基因的缺陷流感病毒能否在动物体内表达外源基因、是否可激发相应的抗体反应。本研究以四周龄的SPF麻鸭为实验动物模型,经肌肉、静脉分别接种表达EDⅢ和Renilla的病毒,同时设阴性对照。免疫两次后,用间接ELISA方法测定麻鸭体内EDⅢ的抗体水平。结果显示：接种表达EDIII病毒组在二免一周内EDIII抗体快速上升,随后下降,静脉免疫抗体高于肌肉免疫。第二次免疫后2周,肌肉接种1035TCID50的鸭坦布苏病毒FX2010,攻毒后1、2、3、4d采血,荧光定量PCR检测麻鸭血液中病毒核酸拷贝数,分析病毒在麻鸭体内的增殖情况。结果显示：攻毒后第一天,接种表达Renilla病毒组的病毒核酸拷贝数和对照组相近,接种表达EDIII病毒组拷贝数较低；攻毒后第二天,接种表达EDIII病毒组病毒核酸拷贝数明显低于接种表达Renilla病毒组和PBS组；第三天和第四天,所有组别的鸭子病毒核酸拷贝数含量下降。接种表达EDIII病毒组有部分免疫保护作用表明EDIII蛋白可在表达EDIII病毒感染鸭体内表达。