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乙酰肝素酶(heparanase)是降解细胞外基质(ECM)和血管基底膜(BM)中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)的唯一一个糖苷内切酶，在肿瘤转移和新生血管生成过程中起着重要作用。目前，heparanase被认为是一个充满前景的抗肿瘤转移新靶点。人们致力于研发能抑制heparanase表达和活性的化合物，希望达到阻止肿瘤转移的目的。本研究旨在建立可靠、灵敏和实用的heparanase活性抑制剂筛选模型，通过筛选化合物得到较高活性的抑制剂，并对其抑制heparanase活性以及抗肿瘤转移和抗新生血管生成作用和机理进行深入的研究。
本研究的第一部分从人胎盘中得到人heparanase的cDNA，通过PCR扩增和基因重组，构建heparanase重组原核表达质粒pGEX-KG-hpse，并导入大肠杆菌Bl21(DE3)中，通过IPTG诱导表达重组融合蛋白。对裂解液上清中的蛋白质经过GST亲和柱层析、蛋白酶切割以及割胶纯化后得到高纯度的目的蛋白。以该蛋白免疫新西兰种大白兔，制作了抗heparanase多克隆抗体，经蛋白印迹和免疫组化方法鉴定，此抗体具有较高的效价和特异性。该抗体进一步被用于考察胃癌组织中heparanase表达与其转移的相关性，结果表明，胃癌组织中heparanase表达与其转移呈现显著的正相关性。Heparanase基因和多克隆抗体的获得，为进一步研究heparanase创造了条件。
第二部分笔者采用具有双启动子的昆虫表达载体pAcUW51以及无血清的昆虫细胞培养体系，率先在国内表达了分泌型的heparanase。通过肝素亲和柱一步纯化，获得了大于95％纯度的高活性heparanase。利用该酶建立荧光HPLC抑制剂筛选模型，对来自海洋硫酸多糖的一系列化合物进行筛选，获得了heparanase抑制剂寡糖化合物JG3，其IC50为6.6ng/ml。当浓度为40ng/ml时，其对heparanase活性的抑制率为97.8％，是阳性对照物肝素的1.5倍多。JG3作为heparanase抑制剂，经表面等离子共振(SPR)技术证实，能与heparanase呈多价高亲和力结合(kd＝72.3 nM)，并被肝素特异性抑制，进一步研究表明，JG3特异性地与heparanase上的肝素结合位点KKDC和QPLK表位结合，从而推测它作为一个底物类似物竞争性抑制heparanase活性。
第三部分对JG3的体内外抗肿瘤效应进行了系统评价。JG3在体外无细胞毒浓度下能显著抑制heparanase高表达的单克隆NIH3T3-hpse细胞和乳腺癌MDA-MB-435细胞的侵袭能力，当浓度为100μg/ml时，抑制率分别为95.3％(NIH3T3-hpse-11)、73.3％(NIH3T3-hpse-4a)和55.7％(MDA-MB-435)；同时，JG3也能显著抑制heparanase激发的ECM中bFGF的释放(浓度为10μg/ml时，抑制率为93.0％)和大鼠动脉环的微血管生成(浓度为100μg/ml时，抑制率为77.0％)。另外，JG3作为硫酸乙酰肝素(HS)的类似物，能与bFGF呈多价高亲和力结合(kd=189nM)，抑制bFGF与细胞表面受体结合，从而抑制FGFR和其下游信号蛋白ERK1/2的磷酸化，进而抑制由bFGF诱导的脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖、迁移和大鼠动脉环的微血管生成。这些结果表明，JG3通过抑制heparanase活性和对抗bFGF依赖的通路抑制细胞的侵袭和新生血管生成。在上述对JG3体外作用研究的基础上，本文应用鸡胚尿囊膜(CAM)模型研究进一步表明，JG3在体内具有显著的呈剂量依赖地抑制血管生成的活性，1mg/egg剂量组抑制率为93.5％。同时，用heparanase高表达的小鼠B16F10黑色素瘤实验性肺转移模型揭示，JG3在体内具有显著的抑制瘤细胞转移的活性，20mg/kg剂量组抑制率为88.1％。最后，我们通过heparanase高表达的裸小鼠MDA-MB-435人乳腺癌原位移植瘤模型进一步证实，JG3在体内抑制瘤细胞肺转移和血管生成，20mg/kg剂量组抑制率分别为88.4％和42.1％，同时也抑制原位移植瘤的增殖，20mg/kg剂量组相对肿瘤增殖率(T/C值)为37.6％。在这两个小鼠模型中，均无明显毒副反应。
综上所述，荧光HPLC模型用作筛选heparanase活性抑制剂是可行的，利用此模型笔者筛选获得了海洋寡糖JG3。JG3是一个伴有bFGF拮抗活性的结构新颖的heparanase抑制剂，因为它在无毒或低毒的剂量下呈现显著的抗新生血管生成和抗肿瘤转移作用，提示其有可能成为一个新型的抗肿瘤药物。