皮肤是人体重要的保护器官,能够阻挡病原体侵入,防止体液流失,调节体温。一旦受到损伤,最理想的状况是尽快修复并且减少疤痕。在皮肤伤口愈合的过程中,细胞外基质起着非常重要的作用,它含有大量纳米尺度的纤维类结构成分,这些纳米结构可以诱导细胞的行为,包括繁殖、迁移等。真皮成纤维细胞和表皮角质上皮细胞是伤口愈合中的主要功能细胞。一旦皮肤受到创伤,成纤维细胞向伤口定向迁移,使伤口收缩,促进愈合,同时,为了迅速覆盖创面,往往需要角质上皮细胞的繁殖和迁移。如果这两种细胞的行为出现异常,就会造成伤口愈合延缓并留下异常疤痕。因此,选择一种能够有效、快速地修复受伤组织,同时减少疤痕形成的材料,并找到一种实时、无损的监测皮肤细胞行为的定量分析方法是很重要的,这将对临床研究皮肤伤口愈合提供参考。近年来,研究者发现纳米尺度三维形貌可以模拟人体的细胞外基质,影响细胞的一系列行为,即纳米形貌对细胞有很强的"接触引导"作用,能够让细胞沿着纳米结构的方向产生定向行为,可以控制和诱导细胞迁移和增殖的方向和速度,在伤口愈合过程中起着重要的作用。然而,目前在各种三维结构上细胞行为的研究,大多采用荧光显微镜、扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)等方法,这些方法涉及复杂的步骤,对细胞具有破坏性,更重要的是,这些方法依赖于终点检测,不能提供动态信息。为了克服这些局限,ECIS(Electric cell-substrate impedance sensing)发展起来并正逐步应用于细胞行为的监测,它是一种实时、无损的定量检测方法。Giaever和Keese将细胞培养在面积很小的金电极上,随着细胞的粘附和铺展,电流被物理阻碍,导致阻抗增加。随后,ECIS应用更加广泛,包括细胞粘附、细胞繁殖、细胞迁移、细胞毒性、药物筛选等方面的研究。本论文主要是将两种人皮肤细胞培养在纳米沟槽上,利用交流阻抗技术监测细胞的定向繁殖和迁移行为,并建立交流阻抗信号与细胞行为之间的相关性。本论文一共包括四章内容,具体如下:第一章绪论本章主要介绍了人皮肤成纤维细胞、人皮肤角质细胞的相关内容,其次介绍了目前国内外对于创伤修复过程的研究,包括二维基底和三维基底上的细胞行为。重点介绍了细胞交流阻抗法,包括其原理,在细胞行为、药物筛选等中的应用等。交流阻抗技术是一种廉价、方便的研究细胞行为的方法,能够实现实时、无损地监测细胞的行为,最大限度获得细胞的原位信息。本章阐明了利用交流阻抗法监测皮肤伤口愈合过程的优势,最后提出了本论文的研究目的和意义以及创新性。第二章纳米沟槽结构的制备及其对皮肤细胞定向行为的诱导在皮肤伤口愈合中,细胞的定向行为对加速伤口愈合起着非常重要的作用。本章在金基底上通过纳米压印技术制备出了线宽为200 nm、周期为400 nm及深度为75 nm的纳米沟槽结构用于模拟体内的细胞外基质。将人皮肤成纤维细胞(HFF)和人皮肤角质细胞(HaCaT)培养在纳米沟槽上,通过普通光学显微镜采集细胞照片,对细胞的延长度和铺展方向进行了统计分析。结果表明,HFF细胞在纳米沟槽上具有良好的延长性,并能够沿着纳米沟槽的方向铺展,而HaCaT细胞的形貌未发生明显变化,铺展方向也呈现无规律性,说明制备的纳米沟槽可以诱导成纤维细胞的定向行为。第三章交流阻抗法监测纳米线上皮肤细胞的迁移过程本章构建了基于纳米沟槽的交流阻抗监测器件,监测了纳米沟槽上两种皮肤细胞在向"伤口"迁移过程中的交流阻抗信号变化,HFF细胞和HaCaT细胞的阻抗均呈现增长的趋势,由于其在纳米沟槽和平面电极上起始伤口的大小不同,HFF细胞在纳米沟槽上的阻抗大于平面电极,而HaCaT细胞在平面电极上较大。通过显微镜观察"伤口"尺寸的变化,发现两种细胞在纳米沟槽上的伤口愈合均较平面电极上快。将交流阻抗响应与伤口愈合率关联之后,发现二者之间存在良好的线性关系,愈合相同的程度时,HFF细胞在纳米沟槽上引起的阻抗变化较平面小,而HaCaT细胞在两种电极上差异不大。第四章交流阻抗法监测纳米沟槽上皮肤细胞的繁殖过程本章将人皮肤成纤维细胞和人皮肤角质细胞培养在纳米沟槽上,利用交流阻抗技术监测了这两种细胞的繁殖过程,结果表明两种细胞在纳米沟槽上的阻抗均随时间增长而增长,且均比平面电极上小;同时以显微镜观察为辅助,定量统计了细胞繁殖过程的细胞数目变化,发现两种细胞在纳米沟槽上的细胞数目和平面电极相比均减小;而且HFF细胞在纳米沟槽上表现了良好的定向行为,另一方面,其繁殖的降低对于减少疤痕的形成具有积极的作用;将繁殖过程的交流阻抗的变化与细胞数目相关联后,发现阻抗响应与细胞数目之间存在一定的线性关系,且相同数目的细胞在纳米沟槽上引起的阻抗小。本论文的研究将为人皮肤创伤愈合的临床研究提供数据和技术支持,以期推动再生医学、整形科学等领域的发展。