T,B淋巴细胞是机体获得性免疫应答的重要组成部分,她们的正常发育是机体对外来微生物入侵产生有效免疫应答的基础,其异常的发育则是自身免疫性疾病的基本病因之一。解开他们的发育过程及分子机制之谜一直是免疫学家孜孜以求的目标。其发育过程是细胞分化,增殖和凋亡等多种基本生命现象协同作用的结果,涉及多种信号转导通路的参与。Notch信号途径是通过膜表面受体介导细胞与细胞间相互作用,来调节前体细胞和干细胞的分化方向,从而调节相邻细胞间分化的基本信号途径之一。它在进化中高度保守,在从线虫到人,从胚胎发育到成年个体的多种系统中都发挥着重要作用。Notch信号通路通过调控前体细胞的分化方向,在淋巴细胞发育中同样发挥着重要作用。这已在淋巴细胞发育的多个环节如T/B细胞的分化、脾脏中边缘带B细胞和滤泡B细胞的分化中得到证实。但Notch信号途径在淋巴细胞发育其他环节中的作用并不清楚,而在已知可发挥作用的环节中的分子机制也为未解之谜。值得注意的是,哺乳类的四种Notch受体都需要转录因子RBP-J介导其转录激活活性,将其敲除可以阻断4种Notch受体的信号,从而获得完全的Notch信号通路的loss of function的模型。为进一步研究Notch信号途径在T淋巴细胞发育和功能中的作用,基于组织特异性剔除Cre-LoxP系统的原理,我们建立了在T细胞中特异性剔除RBP-J的条件性剔除小鼠—Lck-Cre x RBP-Jflox/flox小鼠,并对它们进行了初步的表型分析。为此,我们构建了在T细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因表达载体pLck-Cre,通过显微注射方法,建立了共20系Lck-Cre转基因小鼠。我们将这些小鼠分别与本室拥有的RBP-J条件性剔除小鼠进行交配,并采用Southern Blot对不同Lck-Cre来源的Lck-Cre x RBP-Jflox/+杂合子小鼠的胸腺细胞中RBP-J的剔除效率进行了鉴定,最终鉴定得到胸腺细胞中RBP-J被完全剔除的两系小鼠-M5 Lck-Cre,M19 Lck-Cre。我们进一步将这两系小鼠来源的基因型为Lck-Cre x RBP-Jflox/+的杂合子小鼠进行交配,以获得Lck-Cre x RBP-Jflox/flox小鼠进行表型分析。对M19 Lck-Cre x RBP-Jflox/flox小鼠的表型分析结果显示,剔除小鼠胸腺细胞中αβT细胞发育和γδT细胞发育均未见异常。AnnexinV染色显示剔除小鼠胸腺中DP细胞(CD4+CD8+)的凋亡增加,提示了Notch/RBP-J信号通路在胸腺细胞中的抗凋亡作用。另发现脾脏中RBP-J缺失的CD4 T细胞的体外增殖能力减弱,提示Notch信号通路可促进外周CD4 T细胞的增殖,而且此过程是RBP-J依赖的。M5 Lck-Cre x RBP-Jflox/flox小鼠的表型分析结果显示,纯合子小鼠胸腺中αβT细胞发育受阻,但γδT细胞的发育未见异常,这提示Notch/RBP-J信号通路对αβT细胞的早期发育具有促进作用。本课题组前期的研究发现Notch/RBP-J信号通路还决定了脾脏中B细胞的分化命运,可促进边缘带B细胞的发育而抑制前体细胞向滤泡B细胞的分化,但下游靶基因并不清楚。为此,我们对脾脏中这两群来自于共同前体细胞的B细胞亚群-边缘带B细胞和滤泡B细胞进行了基因表达谱的对比分析,结果显示,共有1226个基因在滤泡B细胞高表达,而1754个基因在边缘带B细胞中高表达。我们对所有差异表达的基因进行了注释、功能分类以及进一步的分析,发现Notch信号通路的一系列分子包括膜表面受体Notch2,胞浆内的调节蛋白Deltex及负调控分子MINT,在两群B细胞中均呈差异表达。与以往的分析一致,Notch信号通路表现为在边缘带B细胞中的高度活化。另外,已知Hes家族分子是Notch信号通路的主要的下游靶基因,芯片结果提示Hes家族成员分子之一Hes5只表达于边缘带B细胞,在滤泡B细胞并不表达,这提示我们Hes5很可能是Notch/RBP-J信号通路调控外周B细胞分化的直接的下游靶基因。随后,我们围绕两群B细胞差异表达的膜表面分子和受体展开了一些工作。首先,基于芯片结果的提示和后续的流式细胞分析,我们发现CD36,一种B型清道夫受体,在边缘带B细胞中高表达,而在滤泡B细胞中几乎不表达;CD68,CD49e在滤泡B细胞中不表达,在边缘带B细胞中以较低水平表达;CD44在两群B细胞中都表达,在边缘带B细胞中的表达水平高于滤泡B细胞。其中CD36因为其特异的表达模式,可以作为边缘带B细胞的新的表面标志。CD36参与脂肪代谢,参与巨噬细胞对P. falciparum感染的红细胞,凋亡的单核细胞和粒细胞的吞噬,它在边缘带B细胞中的特异表达可能与这群B细胞在先天性免疫应答中对血源播散性病原体的清除有关。另外,我们发现两群B细胞呈现多种细胞因子受体的差异表达,这与两群B细胞对细胞因子的差异应答有关。其中,与在对胸腺依赖性抗原应答的作用相一致,滤泡B细胞高表达CD124分子;而半定量RT-PCR的结果显示边缘带B细胞具有较高水平的CD131的mRNA,可能与边缘带B细胞受到刺激后的快速活化有关。最后,芯片结果提示趋化因子受体CXCR7在两群B细胞中呈差异表达。为进一步阐明该受体在介导边缘带B细胞定位中的作用,我们制备了抗趋化因子受体CXCR7的抗血清,发现CXCR7在骨髓,脾脏,淋巴结,腹腔等多种淋巴器官的B细胞上均有表达,但在T细胞表面没有表达。在脾脏中,在新生B细胞的表面没有表达,在滤泡B细胞和边缘带B细胞中均有表达,在后者中的表达较高于前者。CXCR7在腹腔中的两群B细胞中呈现差异性表达,在B1细胞中的表达高于在B2细胞中的表达,可能和B1细胞的特殊定位以及在天然免疫应答中的作用有关。综上,我们建立了在T细胞中特异性剔除Notch信号途径关键转录因子RBP-J的条件性剔除小鼠,在此基础上发现Notch/RBP-J信号通路在体内可抑制胸腺细胞的凋亡,促进外周CD4 T细胞的增殖,这些研究进一步揭示了该信号通路的体内功能。另外,我们对滤泡B细胞和边缘带B细胞进行了基因表达谱的对比分析,进一步的注释分析提示Hes家族成员分子之一Hes5很可能是Notch/RBP-J信号通路调控外周B细胞分化的直接的下游靶基因。后续的工作鉴定出CD36,一种B型清道夫受体,可作为边缘带B细胞的新的表面标志。我们还发现了趋化因子受体CXCR7在脾脏中滤泡B细胞和边缘带B细胞及腹腔中的B1细胞和B2细胞中的差异表达。这些发现在一定程度上丰富了外周B淋巴细胞发育的基本理论,也为深入研究Notch/RBP-J信号通路决定外周B细胞分化的分子机制奠定了基础。