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马铃薯是一种重要的世界性粮食作物,马铃薯病毒病是马铃薯非常重要的一类病害,分布于世界各马铃薯种植区,其中一些马铃薯病毒会严重影响马铃薯的产量和质量。马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV),马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX),马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY),马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)和马铃薯S病毒(Potatovirus S,PVS)是严重危害我国马铃薯产量的5种主要病毒。
实时荧光定量PCR是近年发展起来的一种实时定量检测核酸分子的新技术,SybrGrcenⅠ是最常用的一种非序列特异性的荧光染料,被广泛地应用到实时荧光定量PCR中,本研究采用一种新型的荧光染料EvaGreen,EvaGreen的原理同SybrGrcenⅠ一样,是通过观察荧光强度的变化对整个PCR过程进行实时检测,根据熔解曲线对未知样品进行定性分析,同时通过标准曲线来对标准样品中的核酸分子进行准确的定量分析。EvaGreen相比SybrCrreenⅠ对PCR扩增的抑制作用很小且不容易产生非特异性扩增,更为显著的是,较高浓度的EvaGreen消除了SybrGreenⅠ在制作熔解曲线时所常出现的“染料重分布”的缺陷,因此,EvaGreen更适用于多重实时荧光PCR。基于EvaGreen的荧光定量PCR方法与其它类型的定量方法相比具有简便易行、成本低廉的优点。
本研究首先建立了5种马铃薯病毒的EvaGreen单重实时荧光定量PCR方法,PLRV、PVX、PVY、PVA和PVS这5种马铃薯病毒的单重实时荧光定量PCR方法相关系数(R2)均大于0.99,扩增效率分别为:PLRV1.04、PVX0.92、PVY0.97、PVA1.0、PVS1.02,PLRV、PVX、PVY、PVA和PVS的特异性试验均无非特异性扩增。灵敏性试验表明,5种病毒PCR方法的检测灵敏性分别可达:PLRV25拷贝/μL、PVX25拷贝/μL、PVY50拷贝/μL、PVA50拷贝/μL、PVS10拷贝/μL,实验结果表明:5种病毒的EvaGreen单重实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。
在建立5种病毒的EvaGreen单重实时荧光定量PCR的基础上,我们将5种病毒的引物混合放入同一个荧光PCR管中,利用5种病毒扩增产物Tm值的不同,建立多重EvaGreen实时荧光定量PCR方法对这5种病毒进行检测分析。多重EvaGreen实时荧光PCR通过熔解曲线分析可以区分5种病毒,我们确定5种马铃薯病毒扩增产物的Tm值分别为:PLRV88.4-88.8℃、PVX83.4-83.7℃、PVY80.3-80.8℃、PVA78.4-78.9℃、PVS86.0-86.3℃。灵敏性实验结果表明,多重EvaGreen实时荧光PCR反应在单独检测各病毒时,PVS的灵敏性可以达到100拷贝/μL,PVX和PLRV的灵敏性可以达到250拷贝/μL,PVA和PVY的灵敏性可以达到500拷贝/μL。实验结果表明,5种病毒的多重EvaGreen实时荧光定量PCR方法具有较好的特异性、灵敏性和稳定性。
应用建立的EvaGreen多重荧光定量PCR检测65个田间样品,5种病毒的阳性检出率最低为3.0％,最高达到38.5％,低于单重荧光定量PCR(9.2-49.2％),也略低于普通PCR方法的阳性检出率(4.6-44.6％),但极显著节省了检测成本和时间。总之本研究成功建立了PLRV、PVX、PVY、PVA和PVS5种马铃薯病毒的EvaGreen单重实时荧光定量PCR方法以及EvaGreen多重实时荧光定量PCR方法,可以对这5种马铃薯病毒进行定性和定量的快速检测。