论文部分内容阅读
第一部分:含铜宫内节育器（Copper Intrauterine Device,Cu-IUD）对猕猴子宫内膜的影响【目的】构建猕猴含铜宫内节育器（Copper Intrauterine Device,Cu-IUD）置入模型,分析置器后不同月经周期猕猴宫腔液Cu2+浓度、血清雌孕激素水平、子宫内膜出血相关因子的表达水平及组织病理变化,为研究Cu-IUD致子宫内膜异常出血的机制奠定基础。【方法】选取成年雌性猕猴12只,其中Cu-IUD组9只,对照组3只。Cu-IUD组通过手术置入Cu-IUD（按人与动物体重剂量折算方法,以正常人体置入的宫内节育器的含铜表面积220 mm2为依据计算实验所需的材料大小）,对照组仅作子宫切口处理。术后待观察到猕猴的一个完整的月经周期后,分别在下一个月经周期的月经期（月经周期第2天）、增生期（月经周期第10天）和分泌期（月经周期第20天）收集两组猕猴的宫腔冲洗液、动脉血及子宫内膜组织。其中,Cu-IUD组不同月经周期各取3只猕猴,对照组不同月经周期各取1只猕猴。通过火焰原子吸收光谱法（Flame atomic absorption spectrometry,FAAS）检测两组猕猴不同月经周期宫腔冲洗液中的Cu2+浓度;苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosin staining,HE）分析子宫内膜损伤情况;酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测雌孕激素水平;RT-q PCR及Western Blot分别检测环氧合酶2（Cyclooxygenase-2,COX-2）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase,NOs）的表达。【结果】FAAS结果显示Cu-IUD组不同月经周期Cu2+浓度均明显高于对照组（P<0.05）,其中,月经期差异最大;HE结果显示Cu-IUD组月经期子宫内膜损伤较对照明显,增生期和分泌期未见明显差异;ELISA结果显示Cu-IUD组不同月经周期雌孕激素水平与对照组相比均无明显差异;Cu-IUD组月经期子宫内膜COX-2、VEGF、NOS m RNA及蛋白的表达水平明显高于对照组（P<0.05）,增生期和分泌期未见明显差异。【结论】置入Cu-IUD后猕猴月经期宫腔液中Cu2+的释放显著增加,并导致月经期子宫内膜损伤加重及出血相关因子的表达水平增高,但不影响血清雌孕激素水平。第二部分:Cu-IUD致猕猴子宫内膜损伤修复相关信号通路的初步探索【目的】研究置入Cu-IUD后子宫内膜组织中基因表达谱的变化,并初步探索其参与的子宫内膜损伤修复相关的信号通路。【方法】分别提取Cu-IUD组和对照组不同月经周期子宫内膜组织的RNA,进行二代高通量测序,筛选两组月经期差异表达的m RNA并应用生物信息学方法分析这些差异m RNA参与的生物学过程及分子功能;RT-q PCR对上述部分差异m RNA进行验证并筛选靶标m RNA;Western Blot对关键靶标m RNA进一步验证并通过Western Blot及免疫组化检测其相关的上、下游基因的表达水平,探究Cu-IUD致异常出血可能涉及的通路。【结果】高通量测序结果显示与对照组相比,Cu-IUD组月经期子宫内膜共有953个差异表达的基因,其中上调的有425个,下调的有528个;生物信息学分析结果显示上述部分基因参与了出血损伤、Cu2+代谢、组织修复等相关过程,通过RT-q PCR验证得到的靶标差异基因为:MMP1、MMP2、MMP9、MMP14、MT1A、MT1L、TGF-β1、TGF-β3;Western Blot结果显示Cu-IUD组月经期子宫内膜组织中MMP1、MMP2、MMP9、MMP14的蛋白表达水平均显著高于对照组（P<0.05）,MT的蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.05）,TGF-β1的蛋白表达水平明显低于对照组（P<0.05）,上述结果与RT-q PCR一致;此外,Western Blot及免疫组化结果显示Cu-IUD组月经期子宫内膜组织中TSP1（TGF-β上游基因）的蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.05）,P-SMAD2/3（（TGF-β下游基因））的蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.05）;Cu-IUD组月经期子宫内膜组织中P-P65（磷酸化NF-κB,MMPs上游基因）的蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.05）。【结论】Cu-IUD可显著影响子宫内膜组织中出血损伤、Cu2+代谢、组织修复等相关基因m RNA及蛋白的表达水平,且可能参与子宫内膜损伤修复的相关信号通路:NF-κB/MMPs（损伤通路）及TSP1/TGF-βs/SMAD2/3（修复通路）。第三部分:NF-κB及TGF-β信号通路参与Cu-IUD致人子宫内膜上皮细胞（HEEC）损伤/修复的研究【目的】体外探索NF-κB及TGF-β信号通路参与Cu-IUD致子宫内膜损伤/修复的机制。【方法】选择HEEC作为研究对象,培养液中添加Cu2+进行处理,通过CCK-8法检测Cu2+处理组和未处理组的细胞活力,确定合适的Cu2+浓度,并通过划痕实验确定Cu2+对HEEC损伤修复是否有影响;通过Western Blot及细胞免疫荧光检测Cu2+处理组和未处理组中损伤修复相关基因MMP1、MMP2、MMP9、TGF-β1、P-P65、P65、P-SMAD2、SMAD2、P-SMAD3、SMAD3及TPS-1蛋白表达水平的差异;在上述基因的表达水平存在差异的情况下,通过干扰P-P65或者TGF-β1探索Cu-IUD致HEEC损伤修复的相关通路:（1）损伤通路:在Cu2+处理的情况下,实验组HEEC培养液中添加不同浓度的NF-κB抑制剂（QNZ）,Western Blot检测P-P65、MMP9的蛋白表达水平,划痕实验检测最适浓度下HEEC的损伤修复情况,（2）修复通路:在Cu2+处理的情况下,实验组HEEC培养液中添加不同浓度细胞因子TGF-β1,Western Blot检测P-SMAD2、SMAD2、P-SMAD3、SMAD3的蛋白表达水平,划痕实验检测最适浓度下HEEC的损伤修复情况。【结果】5μg/ml的Cu2+处理HEEC 48小时后,细胞的增殖活力大约为对照组的50%,且划痕实验结果显示5μg/ml的Cu2+处理修复率显著低于对照组（P<0.05）;Cu2+处理HEEC后MMP1、MMP2、MMP9、P-P65的蛋白表达水平明显高于对照组（P<0.05）,TGF-β、P-SMAD2,P-SMAD3及TSP1的表达水平明显低于对照组（P<0.05）;在Cu2+处理的情况下,添加QNZ（100 n M）后,P-P65、MMP9的蛋白表达水平明显降低,且HHEC的损伤修复率显著提高;添加TGF-β1（10 ng/ml）后,P-SMAD2,P-SMAD3的蛋白表达水平明显升高,且HHEC的损伤修复率显著提高。【结论】Cu2+可引起HHEC中MMPs、P-P65蛋白表达水平的上调及TGF-β的蛋白表达水平的下调,且可能通过激活NF-κB/MMP9信号通路（损伤通路）及抑制TSP1/TGF-β/SMAD2/3信号通路（修复通路）从而抑制HEEC的增殖修复作用。