论文部分内容阅读
动物脂肪组织的沉积不仅仅是增加已存在的脂肪细胞中的脂类储藏,而且始终伴随着从祖细胞生成新的脂肪细胞的过程,即“脂肪生成(adipogenesis)"。脂肪生成包括起始阶段多能干细胞向前脂肪细胞“定型”,以及随后前脂肪细胞向成熟脂肪细胞“分化”。在过去的二十年中,人们对调控脂肪生成的调网络,特别是控制前脂肪细胞向脂肪细胞“分化”的转录级联已经基本清楚。而在“定型”阶段,虽然目前已有一些转录因子和信号通路也陆续被证实,但由于缺少前脂肪细胞的标志基因,因此,多能的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)向前脂肪细胞“定型”的特异性定型因子及其分子机制有待进一步研究。已有研究证实,SIRT1在前脂肪细胞分化中,不仅可以去乙酰化组蛋白,调控转录因子的转录活性；而且可以去乙酰化脂肪生成关键转录因子。此外,在MSCs细胞命运决定中,SIRT1可以促进MSCs的成骨分化,而抑制MSCs的成脂分化。但SIRT1调控MSCs成脂定向的分子机制尚不明确,有待进一步阐明。本研究由两部分组成,第一部分为体外细胞实验,研究SIRT1通过Wnt信号通路的对MSCs细胞成脂定向的影响,并阐明SIRT1通过调控Wnt信号通路,影响MSCs分化形成脂肪细胞的分子机制。第二部分为体内活体试验,以SIRT1敲除的小鼠为研究对象,通过动物活体验证SIRT1与脂肪形成的关系；同时以分离的小鼠的胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)为材料,进一步探讨了SIRT1调控MSCs成脂定向的分子机制。主要研究内容和结果如下：第一部分,体外细胞实验。在C3H10T1/2细胞中,对SIRT1用激活剂或抑制剂处理,或干涉/过表达SIRT1后,研究SIRT1对脂肪生成表型及成脂标志基因mRNA和蛋白水平的影响。在此基础上,研究干涉SIRT1对Wnt信号靶基因和关键蛋白的表达及Wnt信号通路报告系统活性的影响；用Real-time PCR芯片筛选出受SIRT1调控Wnt信号通路拮抗物；并稳定干涉这些Wnt信号通路拮抗物后,研究对成脂表型及成脂标志基因mRNA和蛋白水平的影响：通过ChIP和IP等手段,研究SIRT1调控Wnt信号通路的分子机制。主要结果如下：1.添加SIRT1的激活剂白藜芦醇抑制了C3H10T1/2细胞的成脂表型,且成脂标志基因(PPARγ, aP2和adiponectin)的mRNA和蛋白表达也显著抑制；而添加SIRT1的抑制剂烟酰胺则促进了C3H10T1/2细胞的脂滴形成,成脂标志基因(PPARyγ, aP2和adiponectin)的mRNA和蛋白表达丰度显著上调(P<0.05)。白藜芦醇处理显著增加了6h和12h的S期细胞数量(P<0.05),烟酰胺处理对细胞周期影响不显著(P>0.05)。2.在C3H10T1/2细胞中干涉SIRT1,成脂诱导后,增加了油红O染色的脂滴的数目,且显著提高了成脂标志基因(PPARy, aP2和adiponectin的mRNA和蛋白表达丰度；而过表达SIRT1组,视野中油红O染色的脂滴较少,显著抑制了成脂标志基因(PPARγ, aP2和adiponectin)的mRNA和蛋白表达。表明激活SIRT1抑制了MSCs细胞的成脂定向；而抑制SIRT1的活性,则促进了MSCs细胞的成脂定向。3.在C3H10T1/2细胞中干涉SIRT1,显著抑制了Wnt信号通路靶基因CyclinD1的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)以及Wnt信号通路关键分子β-catenin的蛋白水平；Wnt信号通路报告系统实验结果显示,干涉SIRT1显著抑制了Wnt信号通路报告系统的活性(P<0.05)；此外,通过转染β-catenin的突变体质粒,结果发现SIRT1对Wnt信号通路的调控是依赖β-catenin的。4.Wnt信号PCR芯片结果及对芯片的验证结果显示,激活SIRT1显著抑制了Wnt信号通路胞外拮抗物sFRPl和sFRP2以及胞内拮抗物Dactl的mRNA表达水平(P<0.05)；而抑制SIRT1显著提高了Wnt信号通路胞外拮抗物sFRP1和sFRP2以及胞内拮抗物Dactl的mRNA表达水平(P<0.05)。这表明,SIRT1对Wnt信号通路的调控可能是通过Wnt信号的胞外拮抗物sFRP1和sFRP2,以及Wnt信号的胞内拮抗物Dactl来实现的。5.分别建立稳转干涉SIRT1和干涉Wnt信号通路拮抗物的细胞材料：pLKO.1-SIRT1、pLKO.1-SIRT1+pLKO.1-sFRP1, pLKO.1-SIRT1+pLKO.1-sFRP2, pLKO.1-SIRT1+pLKO.1-Dact和pLKO.1-SIRT1+pLKO.1-sFRP1+pLKO.1-sFRP2;成脂诱导这些稳转的细胞,结果显示与pLKO.1-SIRT1组相比,这些细胞的形成的脂滴较少,且成脂标志基因(PPARγ, aP2和adiponectin)的mRNA和蛋白的表达下调；Wnt信号通路报告系统实验结果显示,与pLKO.1-SIRT1组相比,提高了Wnt信号通路的活性。以上结果表明,在MSCs细胞成脂定向过程中,SIRT1可能通过Wnt信号拮抗物sFRP1、sFRP2和Dact1来作用的。6. ChIP结果显示,干涉SIRT1显著增加了sFRP1.sFRP2和Dact1的启动子区域的组蛋白的H3K9和H4K16的乙酰化水平(P<0.05)。此外,IP结果显示,干涉SIRT1显著增加了β-catenin的乙酰化水平,且减少了β-catenin进入细胞核内的水平。这表明,SIRT1可以通过去乙酰化组蛋白和非组蛋白两种方式调控Wnt信号通路。第二部分,体内活体实验。首先,以SIRT1单敲的小鼠(SIRT1+/-)为研究对象,SIRT1野生型小鼠(SIRT1+/+)为对照,验证SIRT1与脂肪形成的关系。正常饮食饲喂12w后,对小鼠称重并取样,对各部位脂肪组织和肝脏称重,并计算脂肪组织与体重的比值；检测血液中甘油三酯的含量；通过外观和HE染色观察脂肪组织的形态；并检测了皮下和内脏脂肪组织中成脂标志基因的变化。然后,分离13.5的小鼠胚胎的MEFs细胞,经基因型鉴定后,对不同SIRT1基因型(SIRT1+/+、SIRT1+/.和SIRT1-/-)的MEFs细胞成脂诱导,研究SIRT1对脂肪生成表型及成脂标志基因mRNA和蛋白水平的影响；此外,以不同SIRT1基因型的MEFs细胞为材料,通过ChIP和IP等手段进一步探讨SIRT1调控Wnt信号通路的分子机制。主要结果如下：1.小鼠正常饮食饲喂12w后,SIRT1+/-小鼠的外观正常,但体重显著低于SIRT1+/+小鼠(P<0.05)；脂肪组织和肝脏质量没有显著差异(P>0.05),但提高了SIRT1+/.小鼠的脂肪与体重质量比(P<0.05)：血液中甘油三酯的含量也没有显著差异(P>0.05)。以上结果表明,SIRT1敲除影响了小鼠生长,但并不影响脂肪组织和肝脏组织的发育,相反可以促进脂肪的形成。2.对脂肪组织的形态研究结果显示,不同基因型小鼠的棕色脂肪组织和附睾脂肪组织外观差异不显著；HE染色结果显示,SIRT1+/.小鼠脂肪组织脂肪细胞的体积有增加的趋势。3.SIRT1+/小鼠显著提高了皮下脂肪(腹股沟脂肪)中PPARy的mRNA表达丰度(P<0.05),对内脏脂肪(附睾脂肪)中PPARγ的mRNA表达没有显著差异(P>0.05);aP2和adiponectin的mRNA在两种基因型小鼠的皮下和内脏脂肪组织中的表达也没有差异。4.成脂诱导MEFs细胞后,SIRT1+/和SIRT1-/组的MEFs细胞脂滴数目较多,而SIRT1+/组最多；SIRT1+/-组的成脂标志基因(PPARγ, aP2和adiponectin)的表达丰度极显著或显著高于SIRT1+/+和SIRT1-/-组(P<0.01；P<0.05)；而SIRT1-/.组的成脂标志基因(PPARγ, aP2和adiponectin)的表达丰度极显著高于SIRT1+/+(P<0.01)。以上结果表明,SIRT1缺失则促进了MEFs细胞的脂肪生成,SIRT1单缺失具有更强的成脂能力。5. ChIP结果显示,在SIRT1缺失的MEFs细胞中,显著增加了sFRP1、sFRP2和Dactl的启动子区域的组蛋白的H3K9和H4K16的乙酰化水平(P<0.05)。IP结果显示,干涉SIRT1缺失增加了P-catenin的乙酰化水平。这表明在SIRT1缺失的MEFs细胞中,SIRT1也可以通过去乙酰化组蛋白和非组蛋白两种方式调控Wnt信号路。本研究的主要结论：SIRT1对间充质干细胞命运选择具有决定性作用,激活SIRT1抑制了MSCs细胞的成脂定向,而抑制SIRT1则促进了MSCs细胞的成脂定向。其机制是一方面SIRT1通过去乙酰化Wnt信号的拮抗物启动子区域的组蛋白,抑制Wnt信号的拮抗物的表达,解除了对Wnt信号通路的拮抗,从而激活Wnt信号通路,抑制脂肪的生成；另一方面SIRT1通过去乙酰化Wnt信号的关键蛋白β-catenin,促进β-catenin在核内的积累,促进Wnt信号通路靶基因活性,抑制脂肪的生成。