肺癌是国内外发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌（Small cell lung cancer,SCLC）是肺癌的两大主要临床病理类型,约有80%-85%的肺癌是非小细胞肺癌。虽然目前非小细胞肺癌的治疗方法很多,但整体治疗效果不理想,总体生存率约为15%。近年来,对非小细胞肺癌发生发展的分子机制做了大量研究,但非小细胞肺癌是在分子生物学特性上具有高度异质性的一组疾病,发生发展受到参与细胞凋亡及增殖的多种信号分子调控。因此,深入阐明非小细胞肺癌发生发展过程中的信号分子及调控机制,对于寻找早期诊断分子及新的治疗策略非常重要。核转录因子RelB是非经典性NF-κB（Nuclear transcription factor kappa B,NF-κB）信号转导通路的主要成员。在静止细胞中,大部分RelB以无活性形式存在于胞浆中,其活化主要依靠NIK（NF-κB inducing kinase,NIK）诱导p100激活p52/RelB复合体,从而导致RelB转移至细胞核内发挥生物学作用,活化的RelB参与免疫反应、炎症反应、肿瘤形成及淋巴细胞发育等多种生物学过程。RelB在前列腺癌组织中表达最常见,且与前列腺癌Gleason评分直接相关。RelB可促进前列腺癌细胞的生长,敲除RelB可增强前列腺癌细胞对辐射的敏感性。我们课题组也发现RelB参与前列腺癌细胞的多种生物学功能,如细胞凋亡,细胞迁移和侵袭能力等。然而,在非小细胞肺癌中RelB表达情况不详,如何发挥生物学作用及作用分子机制也不清楚,国内外鲜有报道。为了深入研究RelB在非小细胞肺癌发生发展中的作用及与临床预后的关系。我们收集非小细胞肺癌患者的临床资料及标本,检测RelB在癌及癌旁组织中的表达情况,结合患者的临床资料,分析RelB能否作为非小细胞肺癌患者的独立预后影响因素之一。我们再通过shRNA干扰技术,建立稳定沉默RelB的非小细胞肺癌细胞株及裸鼠模型,从分子、细胞及动物整体角度,阐明RelB在非小细胞肺癌发生发展中的生物学作用及其对放射敏感性的影响。目的:研究RelB在非小细胞肺癌组织中的表达情况与患者临床资料的关系,探讨RelB能否作为非小细胞肺癌患者的独立预后指标之一。方法:收集非小细胞肺癌患者的组织标本与临床资料,通过免疫组化法和qRT-PCR法检测RelB在癌及癌旁组织中的表达情况。结合非小细胞肺癌患者的临床资料,利用Chi-square统计方法分析癌组织中RelB的表达情况与临床资料的相关性。结合患者的随访资料,利用Kaplan-Meier法计算生存率,利用log-rank检验比较低表达和高表达RelB两组患者的生存率。采用单因素Cox模型分析影响患者预后的临床因素,再进一步利用多因素Cox模型分析影响患者预后的独立风险因素。结果:免疫组化法检测115例非小细胞肺癌患者癌组织及相应癌旁组织中RelB表达情况结果显示:RelB主要在癌组织的细胞浆中表达,细胞核中仅有少量表达,而癌旁组织中未见明显表达。RelB在肺腺癌和肺鳞癌组织中的高表达率分别为:53/83（51.8%）和17/32（53.1%）,二者无统计学差异。qRT-PCR法检测15对非小细胞肺癌患者癌组织及相应癌旁组织中RelB表达情况结果显示:RelB在癌组织的表达水平明显高于相应癌旁组织（p=0.003）。将免疫组化中RelB的表达情况与临床资料作Chi-square统计分析结果显示:癌组织中RelB表达与肿瘤浸润深度（p<0.001）,淋巴结转移（p=0.017）,远处转移（p=0.004）及TNM分期（p<0.001）相关,与性别、年龄、吸烟状态、肿瘤组织分化程度及组织病理类型无关。利用Kaplan-Meier法和log-rank检验生存分析结果显示:高表达RelB患者的总体生存时间较低表达RelB患者短（χ2=32.993,p<0.001）。单因素Cox模型分析结果显示:组织分化程度（HR=2.608,p=0.004）,肿瘤浸润深度（HR=2.196,p=0.015）,淋巴结转移（HR=2.386,p=0.014）,远处转移（HR=2.726,p=0.009）,TNM分期（HR=3.148,p<0.001）及高表达RelB（HR=6.942,p<0.001）都是影响总体生存时间的因素;进一步行Cox多因素生存分析提示:组织分化程度差（HR=2.522,p=0.008）和高表达RelB（HR=6.983,p<0.001）是非小细胞肺癌患者预后的独立影响因素之一。结论:RelB在癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。RelB高表达患者预后差。RelB是非小细胞肺癌患者预后的独立影响因素之一。目的:建立稳定沉默RelB的非小细胞肺癌细胞株。阐明沉默RelB对肺腺癌细胞株（SPC-A1）的生长、增殖、凋亡、迁移和侵袭能力及放疗敏感性的作用及作用机制。方法:1、按照shRNA序列设计原则设计RelB基因的RNA干扰片段,选取质粒pSilencer3.1-H1-neo为载体,合成的干扰片段经高温变性,退火复性及磷酸化后与酶切处理过的质粒链接,构建p Silencer3.1-siRelB质粒。2、转化E.coli TOP 10感受态细菌,挑选单克隆菌提取质粒并最终测序鉴定。再利用Lipofectmine2000进行细胞转染SPC-A1细胞,构建稳定沉默RelB的非小细胞肺癌细胞株。3、以SPC-A1-siRelB与SPC-A1-sictrl细胞为研究对象,利用x-Celligence系统分析RelB对SPC-A1细胞生长的作用。建立动物模型,体内分析沉默RelB对SPC-A1细胞成瘤能力的作用,并用免疫组化技术验证瘤体组织内RelB的表达情况。4、以SPC-A1-siRelB与SPC-A1-sictrl细胞为研究对象,利用流式细胞术分析沉默RelB对SPC-A1细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期的作用,进一步用Western blot分析沉默RelB对SPC-A1细胞AKT信号通路的影响。5、以SPC-A1-siRelB与SPC-A1-sictrl细胞为研究对象,利用x-Celligence系统与划痕实验分析沉默RelB对SPC-A1细胞迁移能力的影响;利用明胶酶谱实验分析沉默RelB对SPC-A1细胞侵袭能力的影响;进一步用Western blot分析沉默RelB后SPC-A1细胞内integrinβ-1表达的变化。6、以SPC-A1-si RelB与SPC-A1-sictrl细胞为研究对象,利用8 Gy剂量辐照细胞后继续培养细胞96h,再用流式细胞术分析辐照后细胞凋亡的变化,进一步用Western blot分析沉默RelB对SPC-A1细胞辐照前后凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2表达变化。结果:1、经测序鉴定成功构建了RelB干扰载体p Silencer3.1-siRelB。2、RT-PCR及Western blot法鉴定结果显示:SPC-A1-siRelB细胞株的RelB的m RNA和蛋白表达比细胞株SPC-A1-sictrl都降低,并且对NF-κB家族其它成员无影响。3、x-Celligence系统实时监测SPC-A1-siRelB和SPC-A1-sictrl细胞生长96小时情况结果显示:SPC-A1-siRelB细胞比SPC-A1-sictrl细胞生长更慢。进一步行裸鼠成瘤实验显示:三周后,皮下种植含SPC-A1-siRelB细胞的成瘤体积（0.36±0.31）cm3较皮下种植SPC-A1-sictrl细胞的成瘤体积（0.89±0.37）cm3小,二者差异有统计学意义（p=0.003）;皮下种植含SPC-A1-siRelB细胞的成瘤重量（0.74±0.26）g较皮下种植SPC-A1-sictrl细胞的成瘤重量（1.03±0.22）g轻,二者差异有统计学意义（p=0.046）。免疫组化结果显示:SPC-A1-siRelB组瘤体组织无RelB表达,SPC-A1-sictrl组瘤体组织RelB正常表达。4、流式细胞术分别检测SPC-A1-siRelB和SPC-A1-sictrl细胞24、48、72及96小时的细胞增殖结果显示:SPC-A1-si RelB细胞增殖明显慢于SPC-A1-sictrl细胞,而细胞凋亡及周期无明显差异。进一步用Western blot法分析沉默RelB对SPC-A1细胞AKT信号通路的作用发现:SPC-A1-siRelB细胞的磷酸化的AKT水平较SPC-A1-sictrl细胞低。5、x-Celligence系统实时监测SPC-A1-si RelB细胞和SPC-A1-sictrl细胞24小时内的迁移能力结果显示:SPC-A1-siRelB细胞迁移慢于SPC-A1-sictrl细胞。划痕实验结果也显示:SPC-A1-siRelB细胞迁移慢于SPC-A1-sictrl细胞。明胶酶谱实验结果显示:SPC-A1-siRelB细胞内MMP-9表达低于SPC-A1-sictrl细胞。6、8 Gy照射SPC-A1-siRelB与SPC-A1-sictrl细胞后继续培养96小时,再用流式细胞术分析辐照后细胞凋亡情况结果显示:SPC-A1-siRelB的凋亡率较SPC-A1-sictrl的凋亡率高,二者差异有统计学意义（p<0.05）。进一步用Western blot检测辐照前后凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2表达变化,发现SPC-A1-siRelB细胞内Bcl-xl蛋白表达水平较SPC-A1-sictrl减少,而Bcl-2表达水平未见明显改变。胞的成瘤重量（1.03±0.22）g轻,二者差异有统计学意义（p=0.046）。免疫组化结果显示:SPC-A1-si RelB组瘤体组织无RelB表达,SPC-A1-sictrl组瘤体组织RelB正常表达。4、流式细胞术分别检测SPC-A1-siRelB和SPC-A1-sictrl细胞24、48、72及96小时的细胞增殖结果显示:SPC-A1-siRelB细胞增殖明显慢于SPC-A1-sictrl细胞,而细胞凋亡及周期无明显差异。进一步用Western blot法分析沉默RelB对SPC-A1细胞AKT信号通路的作用发现:SPC-A1-siRelB细胞的磷酸化的AKT水平较SPC-A1-sictrl细胞低。5、x-Celligence系统实时监测SPC-A1-si RelB细胞和SPC-A1-sictrl细胞24小时内的迁移能力结果显示:SPC-A1-siRelB细胞迁移慢于SPC-A1-sictrl细胞。划痕实验结果也显示:SPC-A1-siRelB细胞迁移慢于SPC-A1-sictrl细胞。明胶酶谱实验结果显示:SPC-A1-siRelB细胞内MMP-9表达低于SPC-A1-sictrl细胞。6、8 Gy照射SPC-A1-siRelB与SPC-A1-sictrl细胞后继续培养96小时,再用流式细胞术分析辐照后细胞凋亡情况结果显示:SPC-A1-siRelB的凋亡率较SPC-A1-sictrl的凋亡率高,二者差异有统计学意义（p<0.05）。进一步用Western blot检测辐照前后凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2表达变化,发现SPC-A1-siRelB细胞内Bcl-xl蛋白表达水平较SPC-A1-sictrl减少,而Bcl-2表达水平未见明显改变。结论:1、成功构建稳定沉默RelB的非小细胞肺癌细胞株SPC-A1-siRelB。2、沉默RelB减弱了SPC-A1细胞的生长,可能是通过下调磷酸化的AKT表达而抑制细胞的增殖起作用。3、沉默RelB抑制了SPC-A1细胞的迁移及侵袭能力,可能是通过下调integrinβ-1的表达发挥作用。4、沉默RelB增强了SPC-A1细胞的放疗敏感性,可能是通过下调Bcl-xl的表达促进细胞的凋亡发挥作用。