茉莉酸类植物激素胶束电动色谱分离与高灵敏度荧光检测新方法

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茉莉酸类化合物(Jasmonates, JAs),包括茉莉酸、茉莉酸甲酯以及茉莉酸与氨基酸结合物等,是一类存在于多种植物体内的内源性植物激素,具有广泛的生理效应,建立内源性JAs的分析方法对研究植物激素作用分子机理具有非常重要的意义。然而,植物体内JAs的含量极低,并且存在多种立体异构性,建立高效、高灵敏度的JAs分离分析方法是植物激素研究面临的主要挑战。毛细管电泳分析技术具有分离效率高、分析速度快、应用范围广、试样消耗少等特点,已成为一种倍受分析科学家关注的分析手段;荧光分析法具有高灵敏度、高选择性、快速响应等优点,与高效液相色谱分离技术联用,应用于植物激素的分析具有独持优势。本文旨在研究茉莉酸类植物激素的胶束电动色谱分离以及高效液相色谱分离与高灵敏度荧光检测联用新方法,并应用于实际样品中JAs的分析,主要内容包括下述三部分:1.茉莉酸-氨基酸结合物的胶束电动色谱分离分析。茉莉酸-氨基酸结合物在植物应激防御反应中起着重要的信号传导作用,生理活性与其非对映异构体结构有关。由于相似的色谱和电泳行为,茉莉酸-氨基酸结合物非对映异构体的分离是一项具有挑战性的工作。本文建立了胶束电动色谱法对五种茉莉酸-氨基酸结合物(茉莉酸-酪氨酸、茉莉酸-亮氨酸、茉莉酸-异亮氨酸、茉莉酸-缬氨酸和茉莉酸-苯丙氨酸)的非对映异构体进行同时分离。考察了影响分离效率的主要因素,如电泳缓冲液浓度和pH、表面活性剂浓度、分离电压和温度等。在最佳实验条件下,五种茉莉酸-氨基酸结合物的十个非对映异构体达到基线分离。该方法具有良好的重复性和稳定性,迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别不超过1.03%和2.07%。在分析的浓度范围内,各分析物具有较好的线性关系,相关系数均大于0.99。该方法成功应用于水稻颍花样品和合成反应原液的分析,加样回收率分别为91.7~107.6%和92.9~107.2%。2.高灵敏度荧光试剂合成及其在茉莉酸高效液相色谱-荧光分析中的应用。茉莉酸是JAs的主要代表,不具有荧光发色团,对其进行荧光衍生化可提高荧光检测灵敏度。本文在荧光素母核上衍生哌嗪基团,合成了荧光素哌嗪试剂。采用核磁氢谱、质谱等鉴定了荧光素哌嗪的结构,考察了其荧光特性,并作为柱前衍生化试剂用于植物激素茉莉酸的荧光标记。在此基础上建立了简单、高选择性、高灵敏度的高效液相色谱-荧光分析新方法用于茉莉酸的分析,并采用离子阱质谱对该方法的特异性进行了验证。考察了影响衍生化反应效率及检测灵敏度的主要因素,包括衍生化试剂用量、缩合试剂用量、反应时间、反应温度、流动相组成和荧光检测波长。在最优化条件下,衍生化产物与荧光试剂可达到基线分离,茉莉酸的线性范围为6×10-9~1×10-6mol/L(相关系数为0.9971),检测限低至4×10-10mol/L。该方法成功应用于腊梅花和茉莉花茶样品中内源性茉莉酸的分析。3.茉莉酸类植物激素毛细管电色谱分离探索。本文探索了毛细管电色谱技术在茉莉酸-氨基酸结合物非对映异构体分离中应用的可能性。利用生物仿生技术,在毛细管内壁形成聚多巴胺薄膜,再将氧化石墨烯共价键合到聚多巴胺层,最后通过物理吸附作用将β-环糊精非共价键合到石墨烯层,采用层-层组装法制备了石墨烯-β-环糊精毛细管电色谱开管柱。考察了该色谱柱对几种茉莉酸-氨基酸结合物的分离性能,结果表明该色谱柱可用于茉莉酸-酪氨酸、茉莉酸-亮氨酸、茉莉酸-异亮氨酸和茉莉酸-苯丙氨酸结合物非对映异构体的拆分。
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