胆管癌(Cholangiocarcinoma,CC)是指发生于胆管上皮细胞的恶性肿瘤,按其发生部位分为肝内胆管癌和肝外胆管癌两大类。在世界范围内,胆管癌占所有胃肠道肿瘤的3%,是继肝细胞癌外第二常见的肝胆肿瘤,尸检资料显示胆管癌的发病率约为0.01%~0.2%。近年来胆管癌的发病率逐年升高,目前手术治疗是胆管癌唯一有效的治疗,然而治疗效果尚欠佳,预后很差,只有少数患者术后能存活5年以上。胆汁酸在脂肪的摄取和脂溶性维生素的吸收方面发挥至关重要的作用,近年来,胆汁酸作为一种信号分子被许多专家和学者所关注。研究发现,胆汁淤积会加速胆管癌的发生;体外试验证明,结合胆汁酸促进胆管癌细胞的侵袭行为。胆汁酸作为配体,能够活化多种受体,包括核受体和膜受体,其中TGR5是一种以胆汁酸为配体的G蛋白偶联受体(GPCR)。TGR5在多种组织和器官中有不同水平的表达,功能多样。TGR5可以调节能量代谢,促进胰岛素的分泌和生物合成,促进B细胞增殖,抑制凋亡,减轻食欲,减缓胃排空;抑制炎症反应和炎症因子的释放,在肝脏中减轻肝脏损伤,延缓脂肪变,促进窦内皮细胞(SEC)凋亡,提高肝脏本身的代谢和微循环等等。值得关注的是,TGR5能够促进正常胆管上皮细胞增殖,抑制其凋亡。TGR5也可以通过激活各种信号通路在多种肿瘤的发生发展过程中发挥作用。研究表明,TGR5促进食管癌,结肠癌和子宫内膜癌细胞的增殖,而在肝癌和胃癌中,则通过抑制STAT3通路抑制其发生与发展,并与胃癌患者预后相关。但目前,TGR5在胆管癌中的作用及其机制研究很少。热休克蛋白(HSP)是细胞在应激状态下合成并表达的高度保守的分子伴侣蛋白,按照其分子量大小分为HSP27,HSP40,HSP60,HSP70和HSP90五个家族。HSP参与多种重要的生理过程,包括蛋白组装,分泌,运输,以及蛋白降解和转录因子的调节等等。Mortalin蛋白属于hsp70家族成员,又名csa,mot,grp75,pbp74,hspa9b,mgc4500,mthsp75等,最早由wadhwa等人在小鼠成纤维细胞中发现。研究表明,mortalin作为一种多功能分子伴侣,介导调控了诸多生理及病理过程,如细胞增殖,细胞器蛋白内稳态,凋亡,蛋白的囊泡运输以及神经退行性变等。鉴于胆汁淤积能够加速胆管癌的发生,胆汁酸受体tgr5有促进胆管上皮细胞增殖,抑制其凋亡的作用,且课题组之前实验证实,在小肠上皮细胞中,tgr5与hsp70家族蛋白mortalin相互结合并发挥作用,我们提出假设:tgr5在胆管癌组织中高表达;tgr5与mortalin相互作用参与胆管癌的发生与发展。并设计进行如下实验:1比较分析tgr5在肝外胆管癌组织和癌旁组织的表达情况,探讨其及与患者临床特征的关系;2观察tgr5对胆管癌细胞增殖,迁移,凋亡等生物学行为的影响;3通过分析tgr5与hsp家族蛋白mortalin的相互作用进一步探讨其作用机制。结果表明,tgr5在肝外胆管癌组织中表达升高,其表达水平与肝外胆管癌病理学恶性程度呈正相关;tgr5促进人胆管癌细胞的增殖与迁移,抑制其凋亡;hsp家族蛋白mortalin参与了tgr5诱导的胆管癌细胞增殖。第一部分:tgr5在肝外胆管癌组织中的表达分析及临床意义探讨目的:对比tgr5在肝外胆管癌患者和癌旁组织的表达情况并探讨其及与肝外胆管癌患者性别,年龄,淋巴结转移与否,病理学分级以及临床分期的关系。方法:收集河北医科大学第二医院肝胆外科2000-2002年胆管癌术后石蜡包埋标本87例,其中有相应癌旁对照组织20例。于河北医科大学第二医院病案室查阅患者临床资料,包括性别,年龄,肿瘤大小,淋巴结转移情况,病理学分级与临床分期。病理证实所取标本均为肝外胆管癌组织,应用免疫组织化学(ihc)的方法检测tgr5的表达水平,并且比较分析20例肝外胆管癌及癌旁组织tgr5的表达情况。检测tgr5的表达水平与肝外胆管癌患者性别,年龄,肿瘤大小,是否淋巴结转移,病理学分级与临床分期等临床数据的关系。结果:1肝外胆管癌患者的临床病理特征归纳详细记录患者临床资料,在87例肝外胆管癌患者中,男性50例(57.5%),女性37例(42.5%);平均年龄58岁,低于等于58岁患者46例(52.9%),高于58岁患者41例(47.1%);高中分化组织63例(72.4%),低分化组织24例(27.6%);有淋巴结转移22例(25.3%),无淋巴结转移54例(62.1%),不能确定有无淋巴结转移11例(12.6%);tnm分期i期15例(17.2%),ii期21例(24.1%),iii期27例(31%),iv期14例(16.1%);其中有相应癌旁对照组织20例。2肝外胆管癌组织中tgr5表达水平高于癌旁组织所有纳入胆管癌组织经he染色证实为胆管癌。为初步判断tgr5是否在胆管癌中发挥作用,本课题用免疫组化的方法,对比了20例肝外胆管癌组织和癌旁组织tgr5的表达情况。结果显示,tgr5主要表达于肝外胆管癌细胞的细胞膜和胞浆;肝外胆管癌组织中tgr5的总体表达水平显著高于癌旁组织tgr5的总体表达水平,说明tgr5在胆管癌组织中高表达。3tgr5的表达水平与肝外胆管癌病理学恶性程度呈正相关为进一步观察tgr5的临床意义,本研究应用免疫组织化学(ihc)方法检测了87例肝外胆管癌中tgr5的表达情况,并按照tgr5在胆管癌腺体中的表达强度将所纳入标本分为1+,2+,3+,4+共4个等级。查阅患者的临床资料,包括年龄,性别,淋巴结转移与否,病理分级与临床分期,并分析tgr5表达强度与临床资料的关系。结果显示,tgr5的表达水平与患者年龄、性别、淋巴结转移以及临床分期无明显相关性。而与肝外胆管癌病理学恶性程度呈正相关,提示其表达水平对胆管癌患者的恶性程度有一定的提示作用。第二部分:tgr5对胆管癌细胞增殖,迁移,凋亡等生物学行为的影响目的:通过建立tgr5过表达和敲低细胞模型,探讨tgr5对胆管癌细胞增殖,迁移,凋亡等生物学行为的影响。方法:在人胆管癌细胞系rbe和qbc-939中过表达或者敲低tgr5,通过cck-8试验检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期变化,westernblot检测增殖标志pcna以及细胞周期蛋白cdc25c和cyclind1表达,brdu掺入实验检测细胞dna合成情况综合评估细胞增殖行为变化;创伤愈合试验检测细胞迁移行为;annexinv/pi双染染色检测细胞凋亡比例,westernblot检测活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)表达评估细胞凋亡行为。结果:1tgr5敲低及过表达胆管癌细胞模型建立应用靶向tgr5的sirna(sitgr5)分别转染胆管癌细胞系rbe和qbc-939,并转染无关对照序列(sicon)作为对照,westernblot检测结果显示,和sicon组比较,sitgr5组tgr5蛋白表达水平明显下降,表明tgr5在两种细胞中的表达均被成功敲低。应用带flag标签的tgr5过表达质粒(flag-tgr5)分别转染rbe和qbc-939细胞,并以仅带flag标签的空载体(flag-con)作为对照,westernblot结果显示,和flag-con组比较,两种细胞flag-tgr5组tgr5表达水平明显上升,表明该质粒在两种细胞中均可成功过表达tgr5。2tgr5促进胆管癌细胞增殖2.1tgr5促进胆管癌细胞中pcna表达westernblot分析结果显示,sitgr5转染细胞72h后,两种细胞系中sitgr5组pcna相对表达水平明显低于sicon组。转染tgr5过表达质粒72h后,两种细胞系中flag-tgr5组pcna相对表达水平明显高于flag-con组。表明在胆管癌细胞系中,tgr5的表达水平与pcna呈正相关。2.2tgr5表达水平与胆管癌细胞活力呈正相关cck-8试验结果表明,转染72h后两种细胞系中sitgr5组od450值较sicon组明显降低。flag-tgr5组细胞活力则较flag-con组明显升高。表明在两种胆管癌细胞系中,tgr5的表达水平与细胞活力呈正相关。2.3过表达tgr5促进胆管癌细胞有丝分裂通过流式细胞术检测tgr5对胆管癌细胞周期的影响。结果显示在rbe细胞中,与flag-con组相比,flag-tgr5组s期细胞所占比例上升,g2期细胞所占比例减少,g1期细胞比例无明显变化,表明tgr5可以促进rbe细胞有丝分裂。在qbc-939细胞中,与flag-con组相比,flag-tgr5组s期细胞所占比例上升,g1期细胞所占比例减少,g2期细胞所占比例减少,表明tgr5可以促进qbc-939细胞有丝分裂。2.4过表达tgr5促进细胞周期蛋白的表达westernblot分析结果显示,在qbc-939细胞系中,与flag-con组相比,flag-tgr5组细胞周期蛋白cdc25c及cyclind1表达显著升高。在rbe细胞中,与flag-con组相比,flag-tgr5组cdc25c蛋白表达升高,而cyclind1表达无明显变化,上述结果表明tgr5可能通过上调促分裂周期蛋白的表达促进细胞增殖。2.5过表达tgr5促进胆管癌细胞dna合成brdu掺入实验结果显示,在两种胆管癌细胞系中,flag-tgr5组较flag-con组dna合成均明显增多。提示过表达tgr5能够促进胆管癌细胞dna合成。以上结果综合提示tgr5可以促进胆管癌细胞的增殖。3tgr5抑制胆管癌细胞凋亡在tgr5被成功敲低以及过表达的基础上,应用annexinv/pi双染染色检测细胞凋亡比例,westernblot检测活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleavedcaspase-3)表达评估细胞凋亡行为。westernblot分析结果显示,两种胆管癌细胞系中sitgr5组细胞较sicon组cleavedcaspase-3表达水平明显增加,flag-tgr5组较flag-con组cleavedcaspase-3蛋白表达水平降低,提示tgr5表达水平与胆管癌细胞cleavedcaspase-3表达呈负相关。annexinv/pi双染染色结果显示,两种胆管癌细胞系中sitgr5组细胞凋亡率较sicon组明显增加。上述结果综合提示tgr5可以抑制胆管癌细胞的凋亡。4tgr5促进肝内胆管癌细胞rbe迁移在成功敲低以及过表达tgr5的基础上,应用创伤愈合实验评估细胞迁移行为。结果显示,在rbe细胞系中,sitgr5组细胞较sicon组划痕愈合明显减慢,flag-tgr5组较flag-con组划痕愈合速度加快。但qbc-939细胞系本身迁移性能较差,无论实验组和对照组细胞均未见明显创伤愈合。以上结果提示tgr5可能促进胆管癌细胞系迁移。第三部分:tgr5通过结合并上调mortalin促进胆管癌细胞增殖目的:通过研究tgr5与mortalin的相互作用,探讨tgr5促进胆管癌细胞增殖的作用机制。方法:在两种胆管癌细胞系中敲低tgr5,从蛋白水平以及mrna水平检测mortalin的表达:将细胞分为以下4组,对照组(flag-con+sicon);tgr5过表达组(flag-tgr5+sicon);mortalin敲低组(flag-con+simortalin),tgr5过表达同时mortalin敲低组(flag-tgr5+simortalin)。通过cck-8试验检测细胞活力,克隆形成试验检测克隆形成率,westernblot检测pcna表达,以确定mortalin是否参与tgr5诱导的胆管癌细胞增殖;并通过免疫共沉淀及免疫细胞荧光双染检测tgr5和mortalin的结合情况。结果:1tgr5促进mortalin蛋白及mrna的表达在两种胆管癌细胞系中敲低tgr5,应用westernblot分析和pcr的方法检测mortalin在mrna水平和蛋白水平的表达。westernblot结果表明,sitgr5组较敲sicon组mortalin明显减少,表明敲低tgr5降低了mortalin的蛋白水平。但敲低mortalin并不影响tgr5表达水平。pcr结果显示,与sicon组相比,sitgr5组的mortalinmrna表达下降,表明敲低tgr5下调了mortalin的mrna水平。2tgr5通过mortalin诱导胆管癌细胞增殖2.1敲低mortalin抑制tgr5诱导的pcna表达增加westernblot分析结果显示,利用靶向mortalin的sirna转染两种胆管癌细胞,可在在两种胆管癌细胞中成功敲低mortalin蛋白,且较flag-con+sicon组相比,flag-tgr5+sicon组的pcna表达明显升高,即上调tgr5可促进细胞增殖,与第二部分结果相一致。而flag-tgr5+simortalin组的pcna表达则显著低于flag-tgr5+sicon组,表明敲低mortalin抑制了tgr5诱导的pcna表达增加。2.2敲低mortalin抑制tgr5诱导的胆管癌细胞活力增加cck-8实验结果显示,与第二部分结果一致,在两种胆管癌细胞中,较flag-con+sicon组,flag-tgr5+sicon组的细胞活力明显升高,提示tgr5可以有效升高胆管癌细胞活力。而较flag-tgr5+sicon组,flag-tgr5+simortalin组的细胞活力显著降低,表明敲低mortalin抑制了tgr5诱导的胆管癌细胞活力的增加。2.3敲低mortalin抑制tgr5诱导的克隆形成增加克隆形成实验结果显示,在两种胆管癌细胞中,较flag-con+sicon组,Flag-TGR5+siCon组的克隆形成数目明显增多,表明TGR5上调可促进胆管癌细胞的克隆成能力;而较Flag-TGR5+siCon组,Flag-TGR5+simortalin组克隆形成数目减少,表明敲低mortalin抑制了TGR5诱导的克隆形成数目增加。以上实验结果综合表明,在胆管癌细胞中,mortalin参与了TGR5诱导的促增殖作用。3 TGR5与mortalin存在相互结合。本研究通过免疫共沉淀和免疫细胞荧光的方法验证TGR5与mortalin是否存在相互结合。在免疫共沉淀实验中,分别在胆管癌细胞系RBE和QBC-939中转染带Flag标签的TGR5质粒(Flag-TGR5),并以带Flag标签的空载体(Flag-Con)作为对照,用抗Flag的抗体进行沉淀,并进行Western Blot分析,用抗mortalin的抗体进行检测,结果显示,mortalin条带仅特异性出现于Flag-TGR5组,表明TGR5和mortalin存在相互结合。免疫细胞荧光染色结果表明,在胆管癌细胞系RBE中,红色荧光标记的TGR5弥散分布于细胞质,绿色荧光标记的mortalin主要定位于核周,核周部分荧光密度较高,两者荧光部分重叠(黄色区域),表明TGR5与mortalin存在部分共定位。上述结果表明,TGR5和mortalin蛋白在胆管癌细胞中存在相互作用。结论:1 TGR5在肝外胆管癌组织中表达升高,其表达水平与胆管癌组织病理学恶性程度呈正相关,TGR5可能参与了胆管癌的发生并对其恶性程度有提示作用。2 TGR5促进人胆管癌细胞的增殖与迁移,抑制其凋亡。3 HSP家族蛋白mortalin参与了TGR5诱导的胆管癌细胞增殖。