【摘 要】
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第一部分HIF-2α和沙利度胺对斑马鱼肠下血管发生发育的影响目的:明确HIF-2α和沙利度胺对斑马鱼肠下血管发生发育的影响。方法:使用HIF-2α过表达质粒对VEGF标记的Tg（fli1a:EGFP）y1转基因斑马鱼进行显微注射,观察斑马鱼肠下静脉表型,对肠下静脉出芽情况进行计数;对HIF-2α过表达斑马鱼胚胎给予不同浓度的沙利度胺干预（200uM、400uM、800uM）,观察斑马鱼肠下静脉出芽
【基金项目】
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国家自然基金面上项目（No:81270474）；
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第一部分HIF-2α和沙利度胺对斑马鱼肠下血管发生发育的影响目的:明确HIF-2α和沙利度胺对斑马鱼肠下血管发生发育的影响。方法:使用HIF-2α过表达质粒对VEGF标记的Tg（fli1a:EGFP）y1转基因斑马鱼进行显微注射,观察斑马鱼肠下静脉表型,对肠下静脉出芽情况进行计数;对HIF-2α过表达斑马鱼胚胎给予不同浓度的沙利度胺干预（200uM、400uM、800uM）,观察斑马鱼肠下静脉出芽情况;使用PCR方法检测斑马鱼VEGF、NOTCH、DLL4等血管生成信号通路的表达差异。结果:HIF-2α过表达后将导致斑马鱼肠下静脉出芽明显增加（4.20±1.48个,P<0.05 vs.对照组）;在沙利度胺干预后,斑马鱼肠下静脉出芽显著减少,尤其在给予800uM沙利度胺干预时,部分斑马鱼肠下静脉表型与正常对照组类似;HIF-2α过表达后,VEGF、NOTCH1a、NOTCH1b、NOTCH2、DLL4表达均出现不同程度的上调,并且沙利度胺能够抑制上述基因的表达。结论:HIF-2α能够诱导斑马鱼肠下静脉异常出芽,并且沙利度胺能够逆转这一作用;HIF-2α能够促进VEGF、NOTCH、DLL4的表达;沙利度胺能够抑制HIF-2α诱导的血管生成信号通路的活化。第二部分HIF-2α和沙利度胺对斑马鱼转录组表达的影响目的:明确HIF-2α和沙利度胺对斑马鱼转录组表达的影响;探讨沙利度胺对内皮细胞非编码小RNA的调控;预测核仁素和snoRNA之间的结合强度和位点。方法:使用高通量转录组测序芯片对HIF-2α过表达和HIF-2α过表达+沙利度胺干预的斑马鱼胚胎模型进行测序分析;使用高通量small RNA测序芯片对沙利度胺干预前后的HUVEC进行测序分析;使用CatRAPID平台对核仁素和snoRNA进行生物信息学预测分析;使用Western Blot和PCR对芯片结果进行验证。结果:三组斑马鱼样本转录组测序分析提示HIF-2α和沙利度胺对血管生成通路中VEGF通路和NOTCH通路存在影响;沙利度胺对核糖体生成通路的表达存在影响,其中核仁素的表达存在差异;HUVEC非编码小RNA测序发现,沙利度胺干预后有13个snoRNA表达出现差异;其中SNORA31是唯一一个沙利度胺干预后表达稳定升高的snoRNA;生物信息学预测发现,SNORA31能够和核仁素高强度的结合,并预测了两者之间的高概率结合位点。结论:HIF-2α和沙利度胺对血管生成通路具有调控作用;沙利度胺能够影响转录组中核糖体生成通路的表达,其中能够使核仁素表达出现差异;沙利度胺能够使SNORA31表达增高;SNORA31能够以较高强度和核仁素蛋白结合。第三部分SNORA31抑制核仁素细胞膜表达初探目的:初步探讨SNORA31对核仁素细胞膜表达的抑制作用。方法:使用免疫组化法验证核仁素在小肠血管畸形患者中的表达;使用小管生成实验验证细胞膜表面核仁素对HUVEC成管的作用;使用细胞免疫荧光法检测Lenti-SNORA31转染HUVEC细胞膜核仁素表达情况,观察SNORA31-siRNAs干扰后细胞膜核仁素表达情况,研究SNORA31片段对HUVEC细胞膜核仁素表达的抑制作用。结果:免疫组化提示在小肠血管畸形标本中,血管内皮细胞核仁素表达升高;在抑制了HUVEC表面核仁素之后,HUVEC成管能力显著下降;干扰SNORA31表达后,HUVEC细胞膜表面核仁素表达有增高趋势;过表达SNORA31将减少核仁素在细胞膜的表达;包含H BOX区域的SNORA31片段能够抑制核仁素在HUVEC细胞膜的表达。结论:核仁素从核仁转移至细胞膜表面表达是血管生成的重要步骤;SNORA31能够和核仁素结合;并且影响核仁素在细胞膜的表达。
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