论文部分内容阅读
糖苷生物碱（steroidal glycoalkaloid，SGAs）是一类具有广泛生物学效应的次生代谢物。在马铃薯块茎中，SGAs含量超过20mg·100g1FW可影响到适口性及食用安全性，降低马铃薯块茎中SGAs的含量对提高其适口性和安全性至关重要。马铃薯块茎SGAs含量高低受遗传因素和环境因子的共同作用，特别是收获后贮藏条件对块茎SGAs积累有较大影响。在环境诸因子中，光对SGAs诱导效果最为显著，但对不同光质的诱导效果及光信号与SGAs合成代谢途径之间的关系尚不清楚。本研究从不同光质对马铃薯块茎SGAs积累的影响和光信号传导、SGAs合成途径相关酶基因表达、关键酶基因克隆及关健酶基因的调控研究，分析诱导SGAs积累的光质及光信号诱导机制，确定SGAs合成关键酶基因，鉴定关键酶基因过表达和抑制表达对块茎SGAs积累的影响，为马铃薯块茎安全储藏和制定SGAs合成的分子调控策略提供理论和技术支撑。主要研究结果如下：1.以马铃薯栽培种不同基因型为材料，对不同光质诱导下的块茎SGAs积累量进行了测定，发现不同光质对块茎SGAs积累诱导效果存在显著差异，不同基因型对光诱导的反应也不同，其中红光诱导块茎SGAs积累的效果最显著，蓝光次之。以不同皮色的马铃薯块茎为诱导材料，同样发现红光处理下的块茎SGAs积累量最大，并且皮色越深的块茎SGAs积累越多。2.对不同光质与第二信使分子含量测定表明，光诱导处理后引起第二信使G蛋白、钙调蛋白和cAMP含量上升，其中红光处理下第二信使的含量上升最多，说明红光是诱导SGAs积累的重要信号分子，推测光诱导的作用可能是启动了红光受体phyB，通过第二信使G蛋白和CaM上调SGAs合成途径相关酶基因表达。3.以4个栽培种和野生种“S.chacoense”为材料，采用qRT-PCR测定了不同光质诱导下的马铃薯块茎SGAs合成途径相关酶HMGR、PSS1、SGT1、SGT2和SGT3及光敏色素phyA、phyB基因的表达水平。结果表明，在基因型和不同组织间、与SGAs合成有关的基因对光质的应答效应不同，但位于SGAs合成途径末端的3个酶（SGT1、SGT2和SGT3）基因表达量都较高，说明多个酶的协同作用，才会显著的改变SGAs的含量。据此可以认为，通过分子调控技术降低块茎SGAs含量，应对多个关键酶基因同时进行抑制或沉默，才有可能达到控制SGAs合成的目的。4.以块茎RNA为模板，采用RT-PCR方法，克隆到鼠李糖基转移酶（SGT3）基因cDNA，与报道的sgt3序列相似性达到99.54%；其ORF长1500bp，编码505个氨基酸残基，具有UDPG糖基转移酶保守结构域及许多重要功能位点；预测的三级结构同糖基转移酶单体结构模型相似，为糖基转移酶家族成员，具有合成类固醇SGAs功能。5.采用PCR技术亚克隆到sgt3保守区序列sgt3-i1、非保守区序列sgt3-i2和保守区兼非保守区序列sgt3-i3，并将这3个序列片段分别反向重复连接到pUCCRNAI上，获得过渡中间载体pSGTRI1、pSGTRI2、pSGTRI3；然后，将反向重复序列同它们的内含子序列一同连接到植物表达载体pCAMBIA2300-Actin1-OCS、 pBIC和pCAMBIA3300上，构建了由Actin启动子驱动的pCARI1干扰载体，由CaMV35S启动子驱动的组成型沉默载体pCSRI2、pCSRI3及超表达载体pCST3，块茎特异性启动子CIPP驱动的沉默载体pBCRI2、pBCRI3及过表达载体pBCT3，并将其导入根癌农杆菌LBA4404。6.分别用pCARI1/LBA4404、 pCSRI2/LBA4404、 pCSRI3/LBA4404和pCST3/LBA4404工程菌转化烟草T12，获得了18株转基因植株，通过PCR检测从中筛选出了12株阳性植株。除草剂抗性筛选结果表明，转基因烟草具有对草丁膦的抗性，表明靶标序列已整合进烟草植株。7．用含有5个干扰载体及2个sgt3过表达载体的农杆菌工程菌对马铃薯试管苗茎段及试管薯薄片进行遗传转化，获得了抗性植株8株。