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认识植物磷代谢的基因调控网络,发掘磷高效基因,从作物自身基因上进行遗传改良,是提高农作物磷利用效率、实现农业可持续发展的根本途径。本文针对前期筛选的5个磷调控转录因子基因,创制了过量表达突变体,并利用创制的过表达突变体及基因敲除SALK突变体对其进行了初步功能分析,以期为筛选植物磷高效基因提供依据,主要研究结果如下: (1)候选磷调控转录因子基因的表达验证。 利用qRT-PCR对5个候选基因at5g55690、at3g03260、at1g30500、at1g66370、at4g01060进行了表达验证分析,结果表明,在缺磷处理条件下5个基因均上调表达,at3g03260在地上部上调表达尤为显著,其他4个基因在地下部上调尤为显著,其参与磷代谢调控的途径可能不同。 (2)磷调控转录因子基因过量表达突变体的创制。 研究克隆了4个候选转录因子基因的全长cDNA,利用植物表达载体P3301构建了at1g30500、at1g66370、at4g01060的过表达植株,利用加入强启动子改造后的PS1300载体构建了a t3g03260过表达植株,通过根癌农杆菌介导,转化拟南芥获得转基因植株,利用抗性筛选及PCR扩增鉴定获得了阳性突变株。 (3)磷调控转录因子基因突变体分析。 候选基因过表达突变体及相应的T-DNA插入突变体一起进行低磷胁迫生理生化指标分析。对根冠比,根长,酸性磷酸酶活性及花色素含量等指标进行了测定。结果显示at4g01060过表达植株根冠比,酸性磷酸酶活性都显著高于野生型,花色素含量则显著低于缺磷下的野生型,而salk组与之完全相反。这表明at4g01060缺磷下促进酸性磷酸酶的合成,促进侧根和根毛的发育。at5g55690在根长和根冠比上有一定表型但不如at4gg01060显著。at1g66370过表达植株在全磷或者缺磷下都能显著提高花色素的含量,其salk组花色素则在全磷或者缺磷下都显著降低,这表明at1g66370促进花色素的合成。另外2个目的基因突变体尽管转录水平有变化但生理表型不显著,可能存在某些补偿途径,具体机制有待进一步研究。 (4)磷调控转录因子基因的原核表达分析。 为进一步寻找候选转录因子基因的靶标基因,构建原核表达载体并获得at5g55690、at3g03260、at1g30500、at1g66370、at4g01060的原核表达蛋白,为进一步实验确认他们的靶基因奠定了基础。 本研究创制的突变体为基因功能研究奠定了重要的基础,筛选出 at1g66370和at4g01060突变体有明显生理表型,值得进一步研究和利用。