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研究背景:在过去的20年中,尽管不断有新的抗癫痫药(antiepileptic drugs,AEDs)投入临床应用,但仍有30%左右的癫痫患者对AEDs不敏感,出现难以被控制的反复发作,临床上称之为难治性癫痫。难治性癫痫的预后不佳,有较高的致残和致死率,属于现代难治病范畴。因此研究难治性癫痫对AEDs产生耐药的原因,发现新的治疗措施,具有重要意义。在肿瘤化疗的过程中发现,长期接触某一种化疗药物产生的不仅对此种化疗药物耐药,而且可对其他结构和功能不同的多种化疗药物产生交叉耐药性的现象,此被称为多药耐药(multidrug resistance,MDR)。研究表明肿瘤细胞膜上表达的多药转运体,能够将化疗药物泵出细胞外,减少了肿瘤细胞内的药物浓度,参与了肿瘤耐药的发生。同样情况也出现在难治性癫痫上,通常如果患者对一种AED耐受,他往往也对其它的AEDs不敏感。研究发现难治性癫痫耐药和肿瘤耐药之间存在相同的病理机制。目前研究认为在生理条件下人体血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)毛细血管内皮细胞和胶质细胞上就有多药转运体的表达,而在难治性癫痫患者病灶切除的标本发现血脑屏障上有高表达的多药转运体。进一步对其功能的研究发现,多药转运体是一类ATP结合蛋白质超家族,能够识别多种作用机制不同的AEDs,主动将药物泵出到BBB以外。因此认为,难治性癫痫患者脑内多药转运体表达增高,引起AEDs通过血脑屏障障碍,患者脑中AEDs浓度下降,可能参与了难治性癫痫多药耐药的发生。P—糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和多药耐药相关蛋白1(multi-drug resisitance associatedprotein,MRP1)是被人们研究最早的两种多药转运体。目的:本研究在建立匹罗卡品癫痫持续状态后慢性难治性癫痫模型的基础上,通过比较不同药物干预下对多药耐药转运蛋白及基因P-gp/MDR1 mRNA和MRP1 mRNA的影响,从行为功能指标和病理组织学两个方面进行疗效分析,观察难治性癫痫大鼠脑内P-gp/MDR1 mRNA和MRP1 mRNA的表达和分布,在形态和功能不同角度研究多药耐药转运蛋白及基因P-gp/MDR1 mRNA和MRP1mRNA在慢性难治性癫痫多药耐药机制中的作用,并探讨难治性癫痫多药耐药可能的分子病理机制,及中药复方柴贝止痫汤对其表达的影响,进而探讨中药干预难治性癫痫的可能机制。材料和方法:本文共分三部分:第一部分:匹罗卡品癫痫持续状态后慢性难治性癫痫大鼠的行为学观察。实验动物及分组:健康雄性Wistar大鼠88只,随机分为5组:正常对照组(8只)、空白模型组(20只)、中西药联合治疗组(20只)、中药治疗组(20只)、西药治疗组(20只)。以不同药物干预,观察致痫大鼠机体状态、癫痫发作的次数、每次发作持续时间、平均持续时间(每次癫痫发作的持续时间总和除以癫痫发作的总次数)、癫痫发作级别、致痫大鼠防卫反应级别及进行体重检测,以判定、分析药物的疗效。第二部分:难治性癫痫大鼠脑组织病理形态学变化。采用HE染色和尼氏染色进行脑组织形态学观察。HE染色观察海马CA1区、CA2区、CA3区、齿状回、额叶、颞叶皮层神经元形态结构的改变,尼氏染色观察海马CA1区、CA2区、CA3区、齿状回、额叶、颞叶皮层脑神经元存活情况、尼氏小体丢失情况。第三部分:中药柴贝止痫汤对难治性癫痫大鼠脑组织P-gp及多药耐药基因MDR1 mRNA和MRP1 mRNA的表达的影响。采用荧光实时定量PCR、免疫组化和Western-blot的方法,观察难治性癫痫大鼠脑内海马和皮层部位多药耐药转运蛋白及基因P-gp/MDR1和MRP1的表达和分布。探讨难治性癫痫多药耐药可能的分子病理机制,及中药复方柴贝止痫汤、卡马西平对其表达的影响。结果:第一部分实验结果1各致痫组大鼠发作总次数的变化:与空白模型组比较,柴贝止痫汤联合卡马西平组、柴贝止痫汤组、卡马西平组的发作总次数减少,有显著性差异(P＜0.05);与柴贝止痫汤联合卡马西平组比较,柴贝止痫汤组的发作总次数增加,有显著性差异(P＜0.05)。2各致痫组大鼠发作总持续时间的变化:与空白模型组比较,柴贝止痫汤联合卡马西平组发作总时间减少,有显著性差异(P＜0.05);与柴贝止痫汤联合卡马西平组比较,柴贝止痫汤组、卡马西平组发作总时间增加,均有显著性差异(P＜0.05)。3各致痫组大鼠治疗前后发作平均持续时间的变化:给药后,与空白模型组比较,柴贝止痫汤联合卡马西平组、柴贝止痫汤组、卡马西平组发作平均持续时间减少,有显著性差异(P＜0.05);与柴贝止痫汤联合卡马西平组比较,柴贝止痫汤组发作平均持续时间增加,有显著性差异(P＜0.05)。与给药前比较,柴贝止痫汤联合卡马西平组发作平均持续时间减少,有极显著性差异(P＜0.01);柴贝止痫汤组、卡马西平组发作平均持续时间均减少,有显著性差异(P＜0.05)。4各致痫组大鼠治疗前后癫痫发作级别的变化:给药后,与空白模型组比较,柴贝止痫汤联合卡马西平组、卡马西平组癫痫发作级别有明显降低,有显著性差异(P＜0.05)。与给药前比较,柴贝止痫汤联合卡马西平组癫痫发作级别明显降低,有极显著性差异(P＜0.01);卡马西平组癫痫发作级别降低,有显著性差异(P＜0.05)。5各致痫组大鼠治疗前后防卫反应级别的变化:给药后,与空白模型组比较,柴贝止痫汤联合卡马西平组、柴贝止痫汤组、卡马西平组大鼠防卫反应级别均有降低,存在显著性差异(P＜0.05);与柴贝止痫汤联合卡马西平组比较,卡马西平组大鼠防卫反应级别增加,有显著性差异(P＜0.05)。与给药前比较,柴贝止痫汤联合卡马西平组、柴贝止痫汤组防卫反应级别均有明显降低,有极显著性差异(P＜0.01);卡马西平组防卫反应级别降低,有显著性差异(P＜0.05)。6各组大鼠体重变化比较:给药前,与正常组大鼠比较,空白模型组、柴贝止痫汤联合卡马西平组、柴贝止痫汤组、卡马西平组体重均减轻,有显著性差异(P＜0.05)。给药后,与正常组大鼠比较,空白模型组、柴贝止痫汤联合卡马西平组、柴贝止痫汤组、卡马西平组体重均减轻,有显著性差异(P＜0.05);与空白模型组比较,柴贝止痫汤联合卡马西平组体重增加,有显著性差异(P＜0.05)与给药前比较,各组大鼠体重均有增加,有显著性差异(P＜0.05)。第二部分实验结果1氯化锂—匹罗卡品慢性难治性癫痫动物模型脑组织海马CA1区、CA2区、CA3区、齿状回,额叶,颞叶皮层神经元出现明显损伤,其病变以海马CA1区、CA3区最明显,其次为CA2区、齿状回、额叶、颞叶皮层。2中药复方柴贝止痫汤、卡马西平能够在一定程度上减轻难治性癫痫大鼠脑组织海马CA1区、CA2区、CA3区、齿状回,额叶,颞叶皮层神经元的损伤,提示二者神经元保护作用的存在。第三部分实验结果采用荧光实时定量PCR、免疫组化和Western-blot的方法检测P-gp、MDR1-mRNA、MRP1-mRNA的表达结果相一致。1与正常组大鼠比较,在难治性癫痫大鼠海马和皮质部位,空白模型组、柴贝止痫汤联合卡马西平组、柴贝止痫汤组、卡马西平组P-gp/MDR1 mRNA、MRP1 mRNA表达含量均有明显增高,具有统计学意义(P＜0.05);柴贝止痫汤联合卡马西平组、柴贝止痫汤组、卡马西平组、空白模型组之间其表达无明显差异,无统计学意义(P＞0.05),但P-gp、MDR1-mRNA、MRP1-mRNA表达量由高到低依次是卡马西平组、空白模型组、柴贝止痫汤组、柴贝止痫汤联合卡马西平组。2正常组、空白模型组、柴贝止痫汤联合卡马西平组、柴贝止痫汤组、卡马西平组,P-gp、MDR1-mRNA、MRP1-mRNA在海马与其在皮质部位表达含量之间无明显差异,无统计学意义(P＞0.05),但皮质部位的表达含量略高于其在海马部位的表达。结论:1匹罗卡品癫痫持续状态后慢性难治性癫痫模型操作简单、成功率高、稳定性好。柴贝止痫汤联合卡马西平的给药方式对难治性癫痫大鼠的疗效优于单独应用卡马西平及柴贝止痫汤,提高了抗癫痫药物对耐药性难治性癫痫大鼠的疗效。2匹罗卡品诱发的癫痫持续状态后慢性难治性癫痫模型,皮层和海马P-gp/MDR1 mRNA和MRP1 mRNA呈高表达。难治性癫痫的耐药可能与P-gp/MDR1 mRNA和MRP1 mRNA的高表达有关。3癫痫的反复发作可以诱导慢性难治性癫痫大鼠海马和皮层P-gp/MDR1mRNA和MRP1 mRNA的表达,当发作与抗癫痫药物如卡马西平共同作用时,多药耐药蛋白、基因的表达增加,反复癫痫发作和抗癫痫药物似乎都参与了对多药耐药蛋白及基因P-gp/MDR1 mRNA、MRP1 mRNA的诱导。4中药复方柴贝止痫汤具有一定的抑制P-gp/MDR1、MRP1的药物转运体功能,可以下调P-gp/MDR1 mRNA、MRP1 mRNA的表达。中药复方柴贝止痫汤对药物转运体抑制功能可能是其治疗难治性癫痫的机制之一,其与适当的抗癫痫药物合用,将有助于难治性癫痫的治疗。