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马立克病(Marek’s disease,MD)是由疱疹病毒科(Herpesviridae)的马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)引起的鸡的一种传染性肿瘤病,以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征,在外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤发生单核细胞浸润。MD不但引起鸡的肿瘤,还损害感染鸡的免疫器官,造成免疫抑制状态,导致机体抵抗力下降和对接种疫苗的免疫应答降低或不应答,引发其他多种疾病的并发和继发感染,造成巨大的经济损失。通过接种致弱的MDV、非致病性的MDV或火鸡疱疹病毒可以预防MD。MD是世界上第一个用疫苗来预防病毒性肿瘤病获得成功的范例,对该病的研究不仅有助于促进养禽业的发展,而且可为探索病毒致病机制、预防和控制人类和动物肿瘤性疾病提供理想的模型。 MDV感染后3～5周,在鸡体内形成T细胞淋巴瘤,由形成的淋巴瘤可以建立MD成淋巴细胞系,马立克病肿瘤相关表面抗原(Marek’s disease tumor-associated surfaceantigen,MATSA)是MD肿瘤细胞和MD成淋巴细胞系细胞表面存在的特异性抗原,是细胞转化的标志。 以单克隆抗体为载体的抗肿瘤导向药物既是医药生物技术领域的研究热点,也是抗肿瘤药物研究的重大课题。本研究就MATSA的分离纯化及其单克隆抗体的研制进行了研究。 1.将液氮中冻存的MDV GA株复苏后,接种9日龄无特定病原体(Specific pathogenfree,SPF)鸡胚成纤维细胞进行复壮,然后用复壮后的MDV GA株感染1日龄雏鸡,从35日龄开始有发病死亡的,典型的内脏型病例剖检可见肝脏、脾脏肿大,其上形成大小不等的肿瘤结节,色灰白,质地坚硬且致密,有些病例的肿瘤呈弥散性生长,整个器官肿大明显,色泽灰白的肿瘤组织与原有组织的色彩相间存在,器官横切面呈大理石花纹状;内脏肿瘤形成率35%(14/40)。 2.将采集的MD病鸡的肝脏和脾脏等肿瘤组织除去筋膜组织后用PBS冲洗几次,剪成1mm~3的小块,用PBS冲洗至无血色,在均质机上匀浆后用PBS洗3次,按1∶20的比例将细胞悬浮于冷的柠檬酸缓冲液中,4℃作用25min;离心,细胞沉淀用PBS悬浮,加入木瓜蛋白酶和L-胱氨酸溶液分离肿瘤细胞表面的MATSA。对木瓜蛋白酶处理前后的肿瘤细胞进行间接荧光抗体染色表明,MATSA被从肿瘤细胞表面去除下来了。间接ELISA表明,提取的液体里面含有目的蛋白MATSA。 3.用DMEM加上胎牛血清培养MSB1细胞,将培养收获的MSB1细胞用磷酸盐缓冲液洗涤3次,除去其中的血清,然后按每2×10~6个细胞加入2IU木瓜蛋白酶和1mmol/L的L-胱氨酸溶液0.1mL,混匀后37℃作用1h,以分离MSB1细胞表面的MATSA,对木瓜蛋白酶处理前后的MSB1细胞进行间接荧光抗体染色以检测MATSA的分离情况。