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随着核科学和核工业的发展,核技术的广范应用,人们在生产、生活、医疗和科研活动中接触到辐射的机会越来越多。电离辐射(Ionizing radiation,IR,以下简称辐射)能导致骨髓和肠道损伤等,而对可能遭受辐照威胁人员或接受放射治疗的患者预先使用电离辐射损伤保护药物则可以明显降低后期的辐射损伤,提高治愈率。但辐射损伤目前尚缺乏确实有效的保护药物,研究和开发辐射损伤保护药物一直是放射医学领域广受关注的热点。染料木黄酮(Genistein)是一种植物雌激素类化合物,具有很强的抗氧化作用,能降低辐射诱导的自由基水平,也可以通过抑制细胞凋亡、调节细胞周期和基因表达、促进DNA损伤修复等机制发挥辐射保护作用,且具有良好的成药性。化学合成的Genistein制剂Bio-300已在美国食品药品监督管理局注册研发并已进入临床试验研究,而我国对于开发Genistein作为辐射损伤保护药物的研究相对滞后。前期,我单位从中草药槐角(Fructus sophorae)中提取槐属甙、再将槐属甙酸解成Genistein的制备工艺获得国家发明专利(ZL02123450.7),从而得到纯度达到药用级的槐角染料木黄酮(Fructus sophorae genistein,FSGen)单体(纯度99%以上),回收率为0.54%,每克成本小于1元,使染料木黄酮作为原料药应用成为可能。其对骨质疏松症的治疗获得国家药物临床研究批件,I期临床试验结果已证明该药物的安全性。但该工艺同时存在着醇提槐角甙增加脱脂和回收醇的步骤,以及氯仿回流脱脂增加成本并污染环境等技术缺陷。鉴于FSGen在辐射损伤保护中的重要作用和前期我实验室的研究基础,本课题拟在前期基础上改进从槐角中提取FSGen的工艺,优化步骤,提高环保标准,节约成本,并对FSGen的辐射损伤保护功能和机制进行探索。为完成上述研究目标,我们开展了以下科学工作:1.在先前提取工艺基础上,我们简化步骤,省略醇提、有机溶剂脱脂步骤,并进行3批提取实验收取FSGen粗品,通过高效液相色谱(HPLC)检测样品纯度,并通过红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、核磁共振(NMR)和质谱(MS)对提取样品进行结构鉴定;2.流式细胞术和Western blotting检测FSGen对辐射诱导小鼠骨髓单个核细胞(BMCs)凋亡的抑制作用,H&E染色、免疫组化染色、免疫荧光染色观察FSGen在体内水平对辐射导致的骨髓损伤的保护作用;3.CCK-8细胞活力检测实验、流式细胞术、Western blotting、单细胞凝胶电泳(SCGE)、细胞衰老检测、细胞活性氧自由基(ROS)检测和细胞免疫荧光染色实验观察FSGen对辐射导致的大鼠小肠上皮细胞(IEC-6)损伤的保护作用;H&E染色、免疫组化染色、免疫荧光染色、酶联免疫吸附试验(ELISA)观察FSGen对辐射导致小鼠小肠组织损伤和炎症的保护作用;4.转录组学测序分析FSGen发挥保护作用的关键分子机制;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、RNA干涉实验(RNAi)、CCK-8细胞活力检测实验、Western blotting和免疫组化染色研究DNA损伤修复基因Rassf1a和Ercc1在FSGen辐射保护作用中的意义。通过上述研究工作,我们得出了以下结论:改进后的FSGen提取工艺得到了高纯度的原料药,提取样品的结构正确,为5,7,4’-三羟基异黄酮,简化步骤后的工艺利于节约成本,保护环境,适于大批量生产;低浓度FSGen能有效抑制辐射导致的BMCs凋亡,皮下注射FSGen能保护小鼠全身受照后骨髓结构的破坏、减少骨髓组织细胞凋亡,保护造血细胞;低浓度FSGen预处理能有效提高X射线照射后IEC-6细胞的活力,减少细胞凋亡,降低DNA损伤程度,降低衰老程度并减少细胞内的ROS,FSGen预先注射给药也能减少辐射造成的小鼠小肠组织结构破坏、减轻炎症程度、减少细胞凋亡程度并缓解氧化损伤程度,提高小鼠的生存率;FSGen对辐射损伤的保护主要通过DNA损伤修复途径进行;FSGen能通过上调Rassf1a和Ercc1基因的表达发挥DNA损伤修复的功能。本课题改良了FSGen提取的工艺,系统研究了FSGen在辐射导致骨髓和小肠损伤中的保护作用,并对FSGen的保护作用分子机制进行了初步探讨,为进一步开发FSGen成为辐射损伤保护药物奠定了基础,也为我国自主知识产权辐射损伤保护药物的发展积累了资料。