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人类天然CD4+CD25+调节性T细胞(nTreg)起源于胸腺,由遗传控制,受抗原识别和多种信号的影响,尤其是细胞因子如IL-2、TGF-?等控制着它们的活化、扩增和抑制功能。其发育可能经历了两个连续的过程,即在胸腺中启动调节表型,获得抑制活性,在外周的淋巴器官进一步活化。人nTreg细胞约占外周血CD4+细胞的5-10%,除组成性地表达IL-2受体α链(CD25)和CTLA-4(CD152)外,还表达GITR、CD62L等。近几年研究发现,forkhead box p3基因编码的一种核蛋白——FoxP3调控着CD4+CD25+T细胞的发育和抑制功能,是Treg细胞更为特异的标记物。Treg具有免疫无能性和免疫抑制性两大特点,即在各种刺激下不发生增殖,也不分泌IL-2、IFN-γ,但经TCR激活后,能够抑制CD4+CD25-效应性T细胞(T-resp)和CD8+T细胞的增殖及其细胞因子的产生,抑制T-resp、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)的抗肿瘤免疫反应,因此Treg细胞在介导对自身抗原的耐受、抗移植排斥反应和抑制肿瘤的免疫应答中发挥着重要的作用。目的(1)探讨人CD4+CD25+调节性T细胞的检测条件、方法,建立不同年龄正常人群的参考值范围,分析其分布规律;(2)检测脐血和新生儿外周血CD4+CD25+T细胞的表型特征,探讨其在母体内和脐血干细胞移植中发挥的作用;(3)体外分离CD4+CD25+T细胞,检测其表型特征,并进行体外扩增实验和功能测定。(4)检测不同治疗阶段急性淋巴细胞性白血病患儿外周血的Treg,探讨其在儿童ALL发生、治疗过程中所处的地位和意义。方法(1)采用双色或三色直接免疫荧光素法标记细胞抗原,包括细胞膜表面、胞浆和胞核抗原,如:CD4、CD25、CD62L、CD45RA、CD45RO、CD152、FoxP3等,多参数流式细胞术检测;(2)应用MACS和FACS分选CD4+CD25+、CD4+CD25-T细胞,FACS测定细胞纯度;(3)分别培养分选纯化后的淋巴细胞,观察CD4+ CD25+T细胞在抗CD3单抗、抗CD28单抗的刺激并有高浓度IL-2存在的情况下能否增殖;(4)进行混合淋巴细胞培养,比色法测定CD4+CD25+T细胞的抑制功能。结果(1)标本分别在室温下放置0h、1h、2h、3h、4h、5h和6h检测时,CD4+CD25hiT细胞分别为(1.41±0.26)%、(1.45±0.26)%、(1.32±0.26)%、(1.27±0.28)%、(1.09±0.24)%、(0.95±0.18)%、(0.91±0.21)%。结合细胞分布特点,将CD25的MFI约是CD4+CD25+细胞2倍的亚细胞群定为CD4+CD25hiT细胞,85%以上的CD4+CD25hi表达FoxP3。(2)4-6岁组、7-14岁组、20-59岁组、60岁以上组健康人群CD4+CD25hi参考值分别是(0.92±0.30)%、(1.21±0.45)%、(1.44±0.52)%及(1.51±0.55)%。(3)脐血及新生儿外周血CD4+CD25+ T细胞呈荧光强度比较均匀一致的独立细胞群,且以CD45RA+亚型为主,成人的Treg则主要是CD45RO+细胞。(4)经300U/mL的IL-2和抗CD3、抗CD28单抗刺激后12天, Treg细胞数量扩增了约1300倍;在混合淋巴细胞培养中,新鲜分选的CD4+CD25+ T细胞可抑制约50%的CD4+CD25-T细胞增殖。(5)标危组治疗不同阶段的ALL儿童CD4+CD25hi数值分别为:首次诱导完全缓解组(1.04±0.33)%,3年以上持续完全缓解组(1.29±0.30)%,维持治疗组(1.60±0.44)%;中/高危维持治疗组为(2.24±0.75)%。结论(1)明确了检测人Treg的最佳条件(即标本应在3h内检测)和分析方法,通过FoxP3表达特征及功能实验证明CD4+CD25hi更能特异性代表和反应Treg细胞的水平。(2)建立不同年龄段正常人CD4+CD25hi T细胞的参考值范围,并发现随年龄变化人Treg也呈现规律性改变。(3)脐血及新生儿外周血CD4+CD25+ T细胞有独特的表型特征,数量较高且功能完好。(4)在特定的培养条件下,Treg细胞可以在体外大幅度扩增,且仍然保持良好的抑制功能。为临床开发、应用Treg细胞治疗自身免疫性疾病提供了实验室依据。(5)与正常儿童相比,ALL儿童除标危首次诱导完全缓解组之外,其他治疗后各期患儿组均存在Treg细胞优势现象,且相同治疗阶段相比,中高危组Treg细胞显著高于标危组。提示Treg细胞与白血病复发、化疗及病情之间均存在密切关系。