论文部分内容阅读
目的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,SE)存在于人的皮肤黏膜表面,由于医疗植入物等手术导致细菌被带入组织深层于植入物表面形成生物膜,造成相关感染。生物膜一旦形成,其耐药性将大大提高,造成临床治疗困难;另一方面,生物膜形成后还可激活耐药基因的表达,使基因表达谱发生改变从而加剧耐药。目前临床治疗生物膜相关感染常常使用大剂量的抗生素,费用较高且容易加剧细菌的耐药性。因此,亟待寻找更加有效且价格低廉的药物来抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成。丹参是中医常用的一种活血化瘀药物,其有效成分丹参酮类化合物具有抗菌、抗炎作用,但研究和临床应用较少。在前期研究中,我们发现丹参酮对SE生物膜形成黏附、聚集及成熟阶段均有抑制作用,但需要较高药物浓度(32μg/ml,为16倍MIC)。有文献表明中药及其活性单体成分在与抗生素联用后对细菌生物膜的抑制作用增强,故本研究旨在探讨丹参酮单体与β-内酰胺类抗生素联用对SE生物膜形成的抑制作用以及生物膜阳性的耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin resistant S.epidermidis,MRSE)耐药基因mec A表达的影响,以期明确丹参活性单体与抗生素联用清除细菌生物膜的可行性,以及对MRSE耐药的逆转作用,为临床治疗和预防SE生物膜和MRSE相关感染提供一个新思路。方法1.利用微量稀释法检测丹参酮单体(二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮)以及β-内酰胺类抗生素(氨苄西林、苯唑西林)对SE的最小抑菌浓度(the minimum inhibitory concentration,MIC)和最小生物膜抑菌浓度(the minimum biofilm inhibitory concentration,MBIC),以及联合用药的部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FICI),筛选对SE生物膜具有较强抑制作用的药物组合。2.体外建立生物膜,根据前期研究选择SE生物膜形成过程中主要的三个阶段的培养时间。利用抑制生物膜最小的FICI药物组合干预不同阶段SE生物膜,分别采用半定量黏附实验检测生物膜基质形成,XTT实验检测膜内细菌代谢活性,扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)检测生物膜整体微观形态的变化,qRT-PCR检测生物膜形成相关基因(icaA、atlE、aap、agrA和stk)表达的变化,研究丹参酮单体与β-内酰胺类抗生素联用对SE生物膜形成的表型以及形成相关基因的影响,寻找药物联用影响SE生物膜形成的可能分子机制。3.体外建立MRSE临床菌株(SE21021、SE26508、SE30291)生物膜模型,使用抑制生物膜最小FICI的组合药物、各药物单用和阳性对照药物万古霉素进行干预,qRT-PCR检测mecA基因、ELISA检测PBP2a蛋白表达的变化,探寻药物联用逆转MRSE耐药的可能性。结果1.对SE生物膜具有协同作用的药物组合为二氢丹参酮Ⅰ和氨苄西林,在生物膜状态下两药联用FICI最小的组合浓度是2μg/ml的氨苄西林加2μg/ml的二氢丹参酮Ⅰ。2.在生物膜的黏附阶段,2μg/ml氨苄西林和2μg/ml二氢丹参酮Ⅰ联合使用可以明显减少生物膜基质形成并且杀死生物膜内细菌,破坏生物膜的微观结构,联用组的抑制作用优于2μg/ml氨苄西林和2μg/ml二氢丹参酮Ⅰ单独使用,并且在作用18h时对生物膜的抑制作用相对更为明显。通过对生物膜形成相关基因的检测,2μg/ml氨苄西林和2μg/ml二氢丹参酮Ⅰ联用降低了黏附阶段生物膜icaA、atlE、aap和stk的表达。在聚集阶段,2μg/ml氨苄西林和2μg/ml二氢丹参酮Ⅰ联合使用可以减少生物膜的基质形成并且杀死生物膜内细菌,破坏生物膜的微观结构,且作用的效果随着作用的时间延长而更显著。联合组的抑制作用仍然优于两种药物单独使用,但是联用组在此阶段并没有抑制生物膜形成相关基因的表达。在生物膜成熟阶段,2μg/ml氨苄西林和2μg/ml二氢丹参酮Ⅰ联合使用对生物膜已基本没有抑制作用,甚至促进了生物膜形成相关基因的表达。3.对于MRSE临床菌株SE21021,2μg/ml氨苄西林与2μg/ml二氢丹参酮Ⅰ联用抑制了mecA的表达,与二氢丹参酮Ⅰ和万古霉素组相比明显降低了mecA的表达;联用组还抑制了PBP2a的表达,且联用组的PBP2a蛋白比氨苄西林单用组和万古霉素组都低,但是比二氢丹参酮Ⅰ单用组高。对于SE26508,各组药物均促进了mecA基因的表达,但是联用组与氨苄西林单用组、二氢丹参酮Ⅰ单用组、万古霉素组相比,mecA基因的表达相对较低;联用组能够抑制该菌株PBP2a的表达,但是效果不如氨苄西林单用组、二氢丹参酮Ⅰ单用组,万古霉素反而促进了SE26508表达PBP2a蛋白。对于SE30291,联用组同时抑制了mec A和PBP2a蛋白的表达,但无统计学意义,万古霉素则促进了mecA基因的表达。结论1.生物膜在进入成熟阶段之前,2μg/ml氨苄西林和2μg/ml二氢丹参酮Ⅰ联合使用对SE生物膜的抑制作用较好,且比两种药物单独使用效果好,但是在进入成熟阶段后联用组的作用受到了明显限制。提示药物的及早干预是防治SE生物膜形成的有效手段。2.2μg/ml氨苄西林和2μg/ml二氢丹参酮Ⅰ联合使用时可以降低MRSE菌株中mecA基因和PBP2a蛋白的表达,但由于实验中菌株数量过少,尚需加大菌株数量和增加耐药的表型检测进一步验证。