流感是由流感病毒引起的一种高度传染性疾病,给人类的健康带来了严重的威胁,针对流感病毒的预防和治疗一直是流感研究中关注的重点。在流感的防治中,单链抗体(scFv)因其分子量小、免疫原性低、穿透力强等优势而备受青睐。大肠杆菌因背景清楚、操作简单、成本低廉等优点而被用于制备scFv。但是由于scFv自身结构的原因,在大肠杆菌中表达的scFv主要以包涵体形式存在且表达量较低,这就极大地限制了利用大肠杆菌优势制备scFv的应用。因此,我们拟通过融合表达的方式在大肠杆菌中获得高表达量的可溶性scFv,建立一种基于大肠杆菌高效、廉价制备抗流感病毒scFv的方法。实验室的前期研究结果已经证实,超折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)具有促进融合蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的性质。因此,我们构建了抗流感病毒H1N1亚型PB2蛋白scFv与sfGFP融合表达质粒,转入大肠杆菌中进行表达,纯化后在体外和细胞中验证了融合sf GFP的scFv的生物活性。结果表明,与单独的scFv相比,融合了sf GFP的scFv在大肠杆菌中的可溶性明显获得了提高。通过进一步优化诱导温度、时间、IPTG浓度等条件,得出最佳诱导表达条件是在18℃,0.1 m M IPTG下诱导表达16 h,并且1 L的细菌培养物可以获得约20 mg的sf GFP-scFv-His融合蛋白。从大肠杆菌中获得的sf GFPscFv-His经TEV酶酶切,Ni珠纯化后可获得纯化的scFv-His蛋白。Western-blot检测发现sfGFP-scFv-His比scFv-His具有更高的稳定性,这些结果表明sfGFP不仅促进了scFvs在大肠杆菌中的可溶性,也提高了scFvs的稳定性。本实验进一步检测了在大肠杆菌中表达的scFv的免疫学活性。Western-blot和ELISA实验结果表明,sfGFP-scFv-His能与PB2特异性的结合;血凝试验和Real-time PCR实验结果表明抗PB2蛋白的sfGFP-scFv-His和scFv-His都具有一定的抗流感病毒H1N1亚型的活性。这些结果表明,我们通过融合sfGFP在大肠杆菌中获得了可溶性的抗流感病毒H1N1亚型PB2的scFvs,并且该scFvs的活性和稳定性很好,对探讨scFvs在抗流感中的进一步应用奠定了坚实的理论基础,同时该研究还提供了一种可溶性表达具有生物学活性的单链抗体的模式,为大规模制备抗流感单链抗体奠定理论基础。