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研究背景目前全球约1/3癫痫患者为耐药性癫痫(DRE),脑内多药耐药基因1(MDR1)编码的P-糖蛋白(P-gp)过表达是导致癫痫患者耐药的主要原因之一,抑制癫痫脑P-gp过表达是未来临床治疗DRE方向之一。我们先前研究发现,癫痫发作能够导致脑组织明显炎性反应,而脑组织炎症反应中的关键因子—核转录因子-κB(NF-κB)炎性通路能够促使癫痫鼠脑内P-gp过表达,抑制NF-κB活性能够下调癫痫脑内P-gp表达。除癫痫本身发作外,抗癫痫药物的使用也是诱导耐药蛋白过表达的重要因素之一,但其具体机制不明。孕烷X受体(PXR)是体内影响药物及外源性物质转运代谢的重要核受体;既往研究证实,其活性与NF-κB炎性信号通路密切相关。因此本研究提出假设:是否可以通过抑制PXR活性,干预NF-κB炎性通路,继而达到阻止癫痫脑P-gp过表达,最终实现抑制癫痫耐药发生。此外,颞叶癫痫(TLE)是临床最为常见的一种DRE,卡马西平(CBZ)是国内外诸多癫痫治疗指南推荐的TLE一线治疗药物,因此文献也有将DRE的特征性之一即是对CBZ耐药。因此本课题探讨能否通过调控脑内PXR/NF-κB信号通路,从而降低癫痫脑P-gp表达,CBZ诱导的脑内P-gp高表达是否与此信号通路有关,为临床治疗癫痫特别是DRE提供理论基础。第一部分 PXR/NF-κB信号通路对急性癫痫发作大鼠脑P-糖蛋白的调节作用目的:探讨PXR/NF-κB信号对急性癫痫发作大鼠脑P-糖蛋白(P-gp)的调节作用,并观察卡马西平(CBZ)对其影响,及CBZ的作用效应与PXR/NF-κB信号通路的相关性。方法:160只S-D大鼠随机分为,(1)假手术组(Sham组),(2)急性癫痫模型组(AEP组),(3)癫痫模型干预组,①PMA(PXR活性抑制剂)干预组,②PDTC(NF-κB活性抑制剂)干预组,③SJW(PXR活性激活剂)组,(4)CBZ治疗癫痫组,①CBZ治疗组,②CBZ组+PDTC干预组,③CBZ组+PMA干预组。海马微量注射海人酸(KA)制作癫痫模型,Sham组注射等体积生理盐水。干预组在KA注射前30 min分别给予侧脑室注射PMA、腹腔注射PDTC、灌胃SJW等;治疗组在癫痫模型制作前、后30 min各CBZ灌胃一次,期间记录各组大鼠死亡率、造模成功率、癫痫发作潜伏期(作为癫痫发作易感性指标)。所有模型于制作完成24 h后断尾采血,后予以快速扼颈而死,各组中5只大鼠脑组织予以Westem Blot(P-gp、PXR、NF-κBp65)与RT-PCR(mdr1a、mdr1b、PXR、p65),其余大鼠模型脑组织予以甲醛固定,行免疫组织化学和免疫荧光双标染色,检测P-gp与PXR、P-gp和NF-κBp65共表达情况,采用ELISA法检测脑组织、血清中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度。结果:1.各组癫痫大鼠死亡率、造模成功率差异无统计学意义。PDTC组发作潜伏期(SOT3=90.35±40.39 min 和 SOT5=105.28±28.26 min)较模型组(SOT3=66.31±12.95 min 和 SOT5=75.69±28.67 min)延长(P<0.05),提示其发作易感性降低;而 PMA 组(SOT3=47.50±23.21 min 和 SOT5=60.57±21.10 min)癫痫发作潜伏期延长(P<0.05),SJW组SOT3和SOT5时间与AEP组相比,差异无统计学意义。2.各组癫痫模型发作后脑组织炎性细胞因子较Sham组均升高(P<0.05),但各组外周血清中炎性因子差异无统计学意义。与AEP组(脑IL-1 β=49.7±2.6 ng/L,IL-6=28.7+7.2 ng/L,TNF-α=42.8±2.4 ng/L)相比,PDTC 干预组脑组织中炎性细胞因子浓度均降低(脑 IL-1β=31.1±2.3 ng/L,IL-6=16.1+8.2 ng/L,TNF-α=28.2±3.0 ng/L),PMA 组脑内促炎性因子浓度(IL-1β=52.5±8.3 ng/L,IL-6=32.5+6.1 ng/L,TNF-α=45.81±7.2ng/L)均有升高趋势,但差异均无统计学意义。与CBZ组相比,CBZ+PDTC组脑组织中炎性细胞因子浓度差异无统计学意义。3.与AEP组相比,PDTC干预组大鼠脑组织mdr1a、p65 mRNA及其P-gp、NF-κB p65蛋白表达降低(P<0.05);NF-κBp65与P-gp有明显共表达;PMA干预组NF-κBp65和P-gp反而有升高趋势,但差异无统计学差异。与CBZ组相比,CBZ+PDTC组脑P-gp、NF-κBp65蛋白表达降低(P<0.05),PXR表达两组差异无统计学意义。其他干预组、CBZ治疗组相应观察指标差异亦无统计学意义。各组间mdr1b mRNA水平差异亦无统计学意义。结论:癫痫急性发作期启动脑组织炎症反应;抑制NF-κB活性降低了脑P-gp及其编码基因mdr1a mRNA表达,同时有减轻急性发作期脑组织炎症反应趋势;而抑制急性癫痫发作期脑PXR活性,未降低脑内P-gp及mdr1a mRNA表达,反而有加剧脑组织炎症反应趋势;CBZ治疗对癫痫发作急性期炎性水平和P-gp表达未见明显影响。综上推测,癫痫发作急性期脑耐药蛋白表达升高,可能与其NF-κB活化所致脑组织炎症反应有关。第二部分PXR/NF-κB信号通路对慢性癫痫大鼠脑P-糖蛋白表达的影响目的:探讨PXR/NF-κB信号对慢性癫痫大鼠脑P-gp的调节作用,并观察CBZ对其影响,及CBZ与PXR/NF-κB信号通路相关性。方法:140只SD大鼠随机分为:(1)生理盐水组(NS组),(2)慢性癫痫(CEP)模型组(KA组),(3)CEP模型干预组,①KA+PMA干预组,②KAPDTC 组,(4)CBZ 治疗 CEP 组,①KA+CBZ 治疗组,②KA+CBZ+PMA干预组,③KA+CBZ+PDTC组。海马注射海人酸(KA)制作癫痫模型,出现≥2次非诱发性发作(即CEP模型)后,干预组分别给予侧脑室注射PMA、腹腔注射PDTC,治疗组予以CBZ灌胃,NS组注射等体积生理盐水。1 w后断尾采血,ELISA法测血清中IL-1β、TNF-α、IL-6浓度;后予以快速扼颈而死,各组中5只大鼠脑组织予以Westem Blot(检测P-gp、PXR、NF-κBp65)与RT-PCR(检测mdr1a、mdr1b、PXR、p65),其余大鼠脑组织予以甲醛固定后,行免疫组织化学染色,观察P-gp、PXR的表达与分布情况。结果:1.120只癫痫造模大鼠中26只死亡,14只未出现非诱发性癫痫发作。与CEP组相比,各干预组(PDTC组、PMA组)和CBZ治疗组癫痫大鼠死亡率、造模失败率、慢性期内癫痫发作严重程度差异均无统计学意义。2.与NS组相比,CEP大鼠脑组织中P-gp及其编码的mdr1a mRNA和PXR及其编码mRNA均升高(P<0.05);使用CBZ治疗一周后上述检测指标进一步升高(P<0.05)。与CEP组相比,KA+PMA组大鼠脑P-gp及其编码的mdr1amRNA和PXR及其编码mRNA下调(P<0.05),而KA+PDTC干预组脑NF-κB表达下降(P<0.05),但脑内P-gp表达差异无统计学意义。PMA干预后,CBZ治疗的癫痫大鼠脑P-gp表达降低(KA+CBZ组V.S.KA+CBZ+PMA组,P<0.05)。3.与NS组相比,各组CEP大鼠脑组织和血清中炎性细胞因子(IL-1β,IL-6,TNF-α)均升高(P<0.05)。KA+PDTC干预组和KA+CBZ+PDTC组大鼠脑组织炎性细胞因子有下调趋势,但差异无统计学意义;而KA+PMA组大鼠脑组织炎症细胞因子水平有升高趋势,但差异亦无统计学差异。结论:癫痫慢性期脑组织与外周循环系统均存在炎症反应;频繁癫痫发作与服用CBZ均能够诱导慢性癫痫鼠脑P-gp高表达;抑制PXR活性,可降低癫痫发作和CBZ所诱导的脑内P-gp高表达,而抑制癫痫慢性期炎性反应对P-gp表达未见明显影响。提示癫痫发作慢性期脑耐药蛋表达升高,可能受PXR表达调控。第三部分P-糖蛋白在癫痫大鼠脑肠肝表达的组织差异性及其与PXR的相关性研究目的:探讨不同癫痫病程(急性期、慢性期、耐药期)P-gp在肠肝脑表达的组织差异性,及其与PXR的相关性。方法:100只S-D大鼠随机分为,(1)假手术组(Sham组),(2)急性期癫痫模型组(AEP组),(3)慢性期癫痫模型,又分为①NS治疗组(NSEP组)、②CBZ 治疗敏感组(CBZ-Responsive Chronic Epielpsy,RCEP 组)、③CBZ耐药组(CBZ-Non-Responsive Chronic Epielpsy,NRCEP 组)。海马微量注射海人酸(KA)制作癫痫模型,模型成功后满24 h为AEP组,急性期过后2 w内至出现≥2次非诱发性发作为慢性期癫痫模型,给予CBZ治疗1 w,期间癫痫总发作频率减少≥50%为RCEP组,<50%为NRCEP组,给予NS治疗为NSEP组。Sham组模型制作及干预试剂均为NS。所有模型于制作完成断尾采血后,后予以快速扼颈而死取脑,并分离肝脏、空肠,甲醛固定,对肠、肝、脑等组织分别进行P-gp、PXR免疫组织化学染色,ELISA法测血与脑组织IL-1β、TNF-α、IL-6浓度,并比较其组织表达差异性。结果:1.癫痫模型急性期死亡3只(3/20),慢性期发作不达标9只(9/60),慢性期死亡32只(32/60),其中11只见于NSEP组,9只死于RCEP组,12只死于NRCEP组;死亡原因除急性期1只造模颅骨钻孔致大量出血外,其余均为发作过度。2.和Sham组比较,急性癫痫发作24 h后(AEP组)脑组织P-gp和PXR均表达升高(P<0.05);与AEP组相比,慢性期癫痫模型脑组织P-gp和PXR蛋白表达均升高,且NRCEP组>RCEP组>NSEP组,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.Sham组、AEP组、NSEP组大鼠肠组织P-gp和PXR蛋白表达差异无统计学意义;与AEP组相比,CBZ治疗的慢性期癫痫模型(NRCEP组与RCEP组)空肠组织P-gp、PXR蛋白表达均明显升高,其中NRCEP组>RCEP组(P<0.05)。4.与Sham组比较,AEP组大鼠肝组织P-gp和PXR表达差异无统计学意义;与AEP组相比,慢性期癫痫模型肝脏P-gp与PXR表达均明显升高,其中NRCEP 组>RCEP 组。5.与Sham组相比,癫痫组脑组织、血清中炎性细胞因子均升高,其中NRCEP组>AEP组>RCEP组>NSEP 组(P<0.05)。结论:癫痫急性发作期仅脑组织中出现P-gp、PXR升高;慢性期癫痫大鼠脑、空肠、肝脏P-gp、PXR表达均明显升高;急性癫痫发作期脑组织炎性水平增高,而耐药性癫痫大鼠脑组织和外周循环系统均处于炎症活化状态。