论文部分内容阅读
目的：近年来，随着免疫低下人群，尤其是移植群体的不断增多，侵袭性真菌病（invisive fungal disease，IFD）和巨细胞病毒病的发病率呈持续上升趋势。其中侵袭性真菌感染的高发病率与高死亡率已经引起了人们的高度关注，早期有效的抗真菌治疗可以明显改善疾病预后，而当前实验室内的常规检测方法由于其敏感性和耗时性等缺陷，难以满足临床的需求，亟需寻求一种更加灵敏和特异的IFD 检测方法,因此需要建立一种IFD 检测用通用PCR 法，为目前临床真菌感染的早期诊断、预防和治疗提供有效工具。此外，HCMV(人巨细胞病毒)的潜伏激活感染也是威胁移植患者生命安全的重要因素之一，随着更昔洛韦的普遍使用，HCMV 对该药耐受日趋严重，已经成为影响移植患者寿命的一个重要因素，因此建立一种方法检测HCMV 更昔洛韦耐药株是非常必要的。
方法：参考文献报道的多种真菌基因组DNA 提取方法，经过改良后，用于相关标本中真菌基因组的提取，并根据真菌核糖体DNA(rDNA)序列，设计通用PCR 扩增引物，以本实验室保存的标准菌株及临床分离菌株作痰标本的检测中, 分别对97 份痰标本进行PCR 扩增和培养鉴定，结果为PCR 阳性89 例，阴性8 例；科玛嘉平板培养7 天后，73 例有真菌生长，24 例无真菌生长，对所有培养产物再进行PCR 扩增，结果73 例真菌菌株PCR 扩增71 例为阳性，2 例为阴性；而24 例阴性培养产物中有14 例PCR 扩增为阳性，10 例为阴性；把PCR 扩增产物进行测序分析，并在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 数据库中进行比对，发现1例为青霉样曲霉感染，其它均为白假丝酵母菌感染。统计结果表明三种方法的真菌检测敏感性顺序为痰直接PCR 法＞痰培养后PCR 法＞痰培养法；另一方面,在痰标本的检测应用中,将其用于采集自46 位患者的118份血浆标本的检测。
结果显示：跟踪随访的46 位患者中有白假丝酵母菌感染患者4 例，烟曲霉感染患者2 例，分支孢子菌属感染患者1 例，肉座菌目/支顶孢属感染患者4 例，肉座菌目感染患者1 例，未知树粉孢属/未知真菌感染患者1 例，未知真菌感染患者18 例，杂菌或其它感染患者1 例，阴性病人11 例，产物测序分析失败患者3 例。ROC 曲线进行分析，将IFD 临床拟诊患者和IFD 临床诊断患者归类为阳性时，ROC 曲线下的面积为0.888，用OD 值判断IFD 的诊断情况具有统计学意义（P=0.000＜0.05），OD 值越高，患者被诊断为IFD 的可能性越大，面积的95％可信区间为（0.787，0.990），不包括0.5，也得出相同的结论，当以OD=47作为IFD 的临界值时，诊断效果最佳，其对应的敏感性和特异性分别为0.938 和0.786；将IFD 临床拟诊患者归类为阴性时，ROC 曲线下的面积为0.85，面积的95％可信区间为（0.74，0.961），当以OD=271.5 作为IFD 的临界值时诊断效果最佳，其对应的敏感性和特异性分别为0.818和0.75。IFD 临床诊断和拟诊患者共计32 例，利用卡方检验（SPSS16.0）对各种检测方法的结果进行统计分析，结果显示P=0.000＜0.05，表明各种检测方法的结果在95％置信水平存在统计学差异，各种检测方法的敏感性和特异性也存在差异，其中PCR 法的敏感性和特异性俱佳，当5种检测方法联合应用时，检测灵敏性高达96.88％（31/32）。HCMV 耐药的检测方面，HCMV DNA 经巢式PCR 扩增，其产物的电泳结果显示7 个条带的相对分子量符合目的基因的大小，测序结果使用DNAstar 分析，与病毒基因文库标准一致。
结论：通过对当前实验室内真菌破壁方法进行了改进，使其破壁更加高效，提高了真菌基因组DNA 的得率，且适合在一般实验室内操作；在前人工作的基础上，建立了IFD 通用PCR 检测法，并初步探讨了其灵敏性、特异性和稳定性，为后续应用奠定了基础；当前国内真菌感染的分子检测仍停留在培养后真菌菌落的检测，本课题组在前期工作的基础上，进一步改进了真菌基因组DNA 的提取方法，使其适合于临床标本的检测；临床应用的结果表明：将电泳图片用软件处理后，可得到定量结果，以电泳图片上靶条带OD 值表示，OD 值越大，患者出现IFD 的可能性越高，无论将拟诊病人归类为阳性还是阴性，均能找到相应的OD 临界值，并且较高的灵敏性和特异性，建议：当OD＜47 时，为患者IFD 阴性；47≤OD≤271.5 为患者IFD 临床拟诊；OD>271.5 为患者IFD 临床诊断。
通过对其PCR产物进行测序分析，可以将病原性真菌直接鉴定到种属水平，而且其结果与患者IFD 的临床诊断结果总体上具有较好的一致性（Kappa=0.424），将PCR 法与其它实验室检测方法联合应用，为IFD 的早发现、早治疗以及提高当前IFD 诊断率初步奠定了基础，应用前景广阔。通过对HCMV-UL97 基因型分析可以有效实现对更昔洛韦耐药的HCMV株的检测。