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血管移植已经在临床上广泛应用。在各种血管移植材料中，管径相当的自体血管仍然是最佳的移植材料，但是来源非常有限。而同种异体血管则是理想的生物血管移植材料，来源广泛。同种异体血管移植后，容易发生移植血管吻合口狭窄，其近期表现为血管内膜细胞变性、附壁血栓形成，在远期则表现为中层平滑肌细胞变性、坏死、纤维化及内膜硬化，进而使管腔狭窄、阻塞。目前，动脉移植术后再狭窄发生率分别为20％-30％，其中50％发生于术后1年内。其发病机理包括：(1)血管损伤，包括免疫反应损伤、手术操作损伤及移植血管壁的缺血再灌注损伤等；(2)血栓形成及机化，多种生长因子被激活引起内膜增生，造成血管内腔狭窄。其病理变化表现为：(1)早期血管内皮细胞变性、脱落，内膜下层裸露；(2)附壁血栓形成、机化；(3)炎性细胞黏附、浸润；(4)中层平滑肌细胞增殖，向新生内膜移行，血管内膜增厚。
针对血管同种异体移植后再狭窄的发生机理及组织学改变，防治策略的焦点在于抑制血管移植后损伤修复过度所致的内膜及平滑肌细胞增生和血栓形成。防治方法包括：降低移植血管的免疫原性，移植前对血管进行必要的预处理(物理处理如冷冻，放射性同位素局部内照射等；化学处理如戊二醛、硫柳汞浸泡等)，减少移植血管壁的缺血再灌注损伤以及手术操作损伤，围手术期进行药物干预(如抗凝剂，抗平滑肌细胞增生剂和促内皮细胞生长剂等)，基因治疗和单克隆抗体技术等。由于血管移植术后再狭窄的发生机理十分复杂，多环节的防治措施势必成为研究的方向。本课题设想寻找一种较为科学合理的降低血管免疫原性的血管移植前预处理方法－程序降温冷冻保存法，并在血管移植前血管腔内应用促内皮细胞生长剂－质粒pcDNA3-VEGF165，探讨对血管同种异体移植术后再狭窄的防治作用。全文分为三部分：
第一部分冷冻保存大鼠肾下腹主动脉同种异体移植的实验研究以SD大鼠作为实验研究对象。在无菌条件及非接触原则下，截取大鼠肾下腹主动脉长约10mm，经程序降温仪梯度降温冷冻后，放入液氮中保存。移植前经37℃水浴复苏后，间置移植于大鼠肾下腹主动脉处，建立冷冻保存动脉同种异体移植后再狭窄的动物模型。通过扫描电镜、组织学染色观察大鼠肾下腹主动脉同种异体移植后血管内膜增生的情况，通过流式细胞仪检测大鼠外周血中的CD4+/CD8+，TCRαβ，CD11b/CD18的改变，观察血管移植前程序降温冷冻保存预处理对血管同种异体移植后机体免疫反应的改变。
结果显示：程序降温冷冻保存复苏后的血管内皮细胞存活率较高(93.5％)，复苏后细胞凋亡率显著上升(7.15±0.422％vs4.86±0.252％，P＜0.05)。冷冻保存的血管移植术后通畅率显著提高(91.6±12.9％vs62.5±26.2％，P＜0.05)。术后CD4+T细胞增多，在4周时达到最高，并持续高表达。CD8+T细胞数量减少，CD4+/CD8+比值在4周时达到最高，两组间有显著性差异。而且T细胞表面的受体TCRαβ也在术后快速上调，变化趋势同CD4+/CD8+，两组间有显著性差异。术后两组的CD11b/CD18均上升，术后第3天达到高峰，而新鲜血管移植组上升更快。组织学检测显示：两组动脉移植术后1天、3天，血管腔内壁局部可见附壁血栓，血小板沉积。术后4周时冷冻保存组术后可见内皮坏死脱落及少量炎性细胞浸润；中层平滑肌未见明显增殖；术后8周时内膜轻度增生，管腔稍狭窄，内皮覆盖完整。
第二部分VEGF165真核表达载体的构建、在内皮细胞中的体外表达及其作用血管内皮细胞生长因子(VEGF)能特异性的促进内皮细胞有丝分裂和增殖。本研究构建了VEGF165的真核表达载体pcDNA3-VEGF165，脂质体介导下将VEGF165基因转染原代培养的人脐静脉内皮细胞，通过RT-PCR、ELISA检测VEGFmRNA及其相应蛋白的表达，通过流式细胞仪检测VEGF对细胞凋亡的影响，通过MTT检测VEGF对内皮细胞增殖的作用。并通过ELISA检测冷冻复苏后兔颈动脉壁细胞VEGF蛋白的分泌以及血管腔内基因转染后血管培养液上清中VEGF蛋白的表达。
结果显示：构建的VEGF真核表达载体pcDNA3-VEGF165经酶切鉴定、菌落PCR鉴定及DNA测序鉴定无误后，以阳离子脂质体介导的基因转染技术，将基因转入内皮细胞中。RT-PCR显示基因转染后细胞内VEGFmRNA水平显著上升；ELISA显示基因转染2天后培养液上清VEGF蛋白表达显著上升(1355.12±62.34vs19.27±2.96pg/ml，P＜0.01)。流式细胞仪结果显示转染VEGF165基因2天的内皮细胞再经程序降温冷冻保存复苏后，其存活率显著高于对照组(90.13％±2.84％vs81.52±2.15％，P＜0.05)，凋亡率显著低于对照组(7.15±0.42％vs17.61±1.56％，P＜0.05)。MTT法显示转染的VEGF165基因能明显促进内皮细胞的增殖。ELISA法显示冷冻保存的兔颈动脉复苏5天后，血管壁细胞分泌的VEGF蛋白接近正常水平，而血管腔内转染VEGF165基因的血管培养液上清中VEGF蛋白的表达显著上升，与对照组比较有显著性差异。
第三部分腔内应用VEGF基因防治冷冻保存兔颈动脉同种异体移植术后再狭窄的研究完整的内皮层能维持平滑肌细胞的收缩表型，有助于防止血栓形成，血小板聚集，降低局部促进平滑肌细胞增殖的生长因子浓度，从而抑制平滑肌细胞的增殖。本研究将VEGF基因通过血管腔内球囊扩张的办法导入血管壁细胞，应用RT-PCR及免疫组织化学的办法检测VEGFmRNA，c-mycmRNA，VEGF蛋白的表达，通过扫描电镜检测VEGF对移植血管内皮细胞生长的作用，并通过组织学检测评价其对再狭窄的干预作用。
结果显示：治疗组术后1天就可以见到少量VEGF165mRNA表达，术后3天表达至高峰，维持至术后2周时表达才明显降低；VEGF蛋白术后3天即有表达，术后1周达到高峰，术后2个月明显降低；与基因、蛋白表达相对应，扫描电镜显示治疗组内皮修复时间提前，术后1个月，移植血管内皮完全覆盖。对照组术后1天c-mycmRNA的表达就达到高峰，以后表达逐渐降低，术后1周时恢复至术前极低水平。而治疗组c-mycmRNA表达变化趋势同对照组，两组之间没有显著差异。组织学检测结果同基因及蛋白的变化密切相关，组织学检测显示两组术后血管壁内膜/中膜比值逐渐增加，但是两组之间没有显著差异。
结论：本研究结果表明冷冻保存降低了移植血管的免疫原性，减少了移植以后免疫反应，血管移植术后的通畅率显著提高，在一定程度上抑制了血管移植术后再狭窄的发生。本研究构建的pcDNA3-VEGF165质粒转染后能显著促进细胞表达VEGF蛋白，具有较强的促内皮细胞生长的作用。在采用VEGF165基因血管腔内治疗时，尽管血管壁细胞能摄取基因并且表达、分泌具有生物活性的蛋白，能使移植血管内皮层修复提前，但是尚不足以抑制血管内膜的增殖，抑制平滑肌细胞的增生，防治血管移植术后再狭窄的形成。