【摘 要】
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角膜缘干细胞缺乏症（Limbal stem cell deficiency,LSCD）是由于角膜缘干细胞（Limbal stem cells,LSCs）功能障碍或数量不足引起的一种病理现象,角膜上皮被结膜上皮细胞所取代,表现为角膜混浊且出现大量新生血管,视力下降甚至失明。药物治疗或常规手术治疗效果不理想。有研究报道采用含LSCs的角膜缘上皮细胞片自体移植（Autologous cultivated
【基金项目】
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十三五国家重点研发计划子课题（2016YFD0501010）； 江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）； 江苏高校品牌专业建设工程资助项目（TAPP）；
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角膜缘干细胞缺乏症（Limbal stem cell deficiency,LSCD）是由于角膜缘干细胞（Limbal stem cells,LSCs）功能障碍或数量不足引起的一种病理现象,角膜上皮被结膜上皮细胞所取代,表现为角膜混浊且出现大量新生血管,视力下降甚至失明。药物治疗或常规手术治疗效果不理想。有研究报道采用含LSCs的角膜缘上皮细胞片自体移植（Autologous cultivated limbal epithelial transplantation,auto-CLET）技术可重建角膜上皮层,恢复角膜缘屏障功能,但在宠物犬的相关试验研究尚未见报道。本试验以无上皮层羊膜为载体,体外构建含LSCs的原代角膜上皮细胞植片,并对LSCD疾病模型犬进行auto-CLET手术治疗,以常规的羊膜移植术和结膜瓣遮盖术为对照组,术后进行眼表临床检查、角膜病理组织学和免疫组化染色观察,以评估其对LSCD疾病模型犬的治疗效果。1.含LSCs犬原代角膜缘上皮细胞植片的构建与鉴定本试验手术采集剖腹产犬胎儿羊膜,采用Dispase Ⅱ酶消化法制作无上皮层羊膜。手术采集3 mm2健康犬角膜缘组织,采用组织块培养法和Dispase Ⅱ酶消化法以无上层羊膜为载体体外培养犬原代角膜缘上皮细胞。根据细胞形态特征、超微结构特点、病理组织学和细胞标志物CK12、ABCG2和p63等进行角膜缘上皮细胞以及LSCs的鉴定。结果显示:Dispase Ⅱ酶消化后的羊膜表面无羊膜上皮细胞残留,暴露的基底膜由大量纵横交错的胶原纤维丝组成,胶原纤维丝完整,无受损或断裂。培养的原代角膜缘上皮细胞为多边形,扫描电镜可见细胞表面有大量微绒毛和微皱,细胞之间以及细胞与羊膜间连接紧密。犬原代角膜缘上皮细胞可在羊膜表面生长为2～3层,并表达角膜上皮细胞标志物CK12以及LSCs标志物ABCG2和p63,表明制作的原代角膜缘上皮细胞移植片含有LSCs,可用于后续的auto-CLET手术。2.含LSCs犬原代角膜缘上皮细胞片自体移植对LSCD疾病模型犬疗效的临床观察本试验选取15只健康比格犬,采用板层切除术建立LSCD疾病模型犬,造模后每7d对实验犬的术眼进行裂隙灯检查和印记细胞学检查,直至实验犬的术眼表面完全被纤维血管膜覆盖,印记细胞学检查角膜表面出现杯状细胞,确定弥漫性LSCD疾病模型犬造模成功。将LSCD疾病模型犬分为三组,分别实施auto-CLET手术、羊膜移植手术和结膜瓣遮盖手术。术后使用裂隙灯观察,对角膜的混浊度、新生血管和荧光素钠染色情况参照相关标准进行评分,并进行基础泪液分泌实验（Schirmer I test,SIT）、泪膜破裂时间（Tear film breakup Time,BUT）和印记细胞学检查（Impression Ctology,IC）评估术后是否存在干眼并发症。结果显示:造模术后35 d时,实验犬角膜表面完全被灰白色纤维血管膜覆盖,角膜混浊不透明,荧光素钠染色大面积着色,IC检查结果显示角膜表面出现杯状细胞,表明角膜上皮被结膜上皮取代,LSCD疾病模型犬造模成功。术后4个月时,auto-CLET组角膜透明度与正常角膜无差异,角膜缘界线清晰,无新生血管入侵,角膜表面荧光素钠点状着色。羊膜移植组和结膜瓣遮盖组角膜表面均存在大量新生血管,角膜混浊,荧光素钠着色。羊膜移植组和结膜瓣遮盖组角膜混浊度和新生血管评分均极显著高于auto-CLET组（p<0.01）,羊膜移植组角膜荧光素钠着色评分显著高于auto-CLET组和结膜瓣遮盖组（p<0.05）。根据治疗效果评估标准,auto-CLET组治疗成功率为77.78%,羊膜移植组和结膜瓣遮盖组均为0。三组术后BUT、SIT和IC结果均低于正常水平,且角膜表面荧光素钠着色,表明三组犬术后均存在干眼症。但auto-CLET组BUT与羊膜移植组和结膜瓣遮盖组相比极显著增加（p<0.01）,auto-CLET组IC等级极显著低于羊膜移植组和结膜瓣遮盖组（p<0.01）,表明auto-CLET组与羊膜移植组和结膜瓣遮盖组相比干眼症较轻。3.含LSCs犬原代角膜缘上皮细胞片自体移植后角膜组织学和免疫组化染色观察将LSCD疾病模型犬分为3组,分别于术前、术后第1、2和4个月采集术眼角膜样品。对采集的眼角膜进行病理组织学和免疫组化染色观察。结果显示:LSCD疾病模型犬角膜表面被结膜上皮覆盖,与基质层连接疏松,有大量新生血管和炎性细胞浸润,PAS染色可见杯状细胞。术后4个月时,auto-CLET组角膜上皮层由5～6层细胞组成,角膜各组成结构与正常角膜相似,角膜缘上皮基底细胞阳性表达p63和ABCG2。羊膜移植组和结膜瓣遮盖组角膜上皮层细胞排列杂乱,与基质层连接疏松,均有大量新生血管和炎性细胞浸润,角膜缘上皮基底细胞均不表达p63和ABCG2。上述试验结果表明,含LSCs的犬原代角膜缘上皮细胞移植片自体移植后成功在角膜表面成活,重建LSCD疾病模型犬角膜上皮层并恢复角膜缘屏障功能,术后角膜透明,无新生血管,成功率高达77.78%。
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