背景 肿瘤放射治疗是恶性肿瘤治疗的一种重要手段，广泛应用于皮肤癌、鼻咽癌、乳腺癌和淋巴瘤等。放射治疗与手术、化疗、生物治疗和中医治疗等联合大大提高了肿瘤临床疗效和病人的生存质量。肿瘤放射治疗最佳效果在于最大程度杀伤肿瘤细胞而尽量降低正常组织细胞的放射损伤。即在正常组织能够耐受的条件下，最大限度地杀灭肿瘤细胞，但临床上往往难以控制在射线杀灭肿瘤组织的同时而不损伤正常组织。近年来随着医疗保健事业的发展和核工业技术的广泛应用，医源性照射和非医源性照射引起的正常组织细胞辐射损伤正日益受到放射学家的关注，如长期暴露于低剂量电离辐射和偶发的核事故，引起组织变性坏死，局部皮肤放射性烧伤、免疫功能下降、组织器官功能低下和细胞基因突变诱发为癌前病变等，严重者甚至出现器官衰竭，临床上出现急性放射和慢性放射综合症。因此，研究辐射损伤的分子机理和寻找一种新型的有效、毒副作用小的辐射防护药物是辐射防护学亟待解决的关键问题。 还原型辅酶NADH，又名烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，参与呼吸链电子传递和能量代谢过程，在核酸、蛋白质和多糖合成以及物质转动过程中具有十分重要的作用。NADH是通过呼吸链电子传递先被传递至NAD再还原成NADH，1分子NADH最后可产生3分子ATP。NADH在线粒体内能够抑制自由基生成和线粒体膜电位下降等。神经细胞缺乏NADH可导致神经元变性坏死，并与阿尔茨海(里犬灬)病遗传易感性存在一定相关性。紫外线照射后表皮细胞内NADH含量与表皮细胞发展为癌前病变有关。组织细胞辐射后，细胞内NADH含量下降，参与细胞DNA修复的PARP失活，导致细胞辐射后修复能力下降。通过外源性给予NADH，能够增加神经细胞多巴胺神经递质释放，改善帕金森氏综合症；能够抗鱼藤酮引起的细胞损伤及调节细胞凋亡相关基因表达。所以通过NADH药物修饰或调节辐射对细胞的损伤，不失为研制一种新型的辐射防护剂提供一种新的研究思路和方法。第一军医大学博士研究生学位论文目的 本研究从辐射损伤后细胞形态学和线粒体细胞凋亡信号传递途径改变研究正常肝细胞株L02和外周血免疫细胞辐射损伤，探讨NADH对抗辐射损伤的作用机制。并通过体内实验研究NADH对昆明小鼠辐照防护作用，探讨NADH抗辐射损伤修复能力。从而为减小肿瘤临床放射治疗引起的正常组织并发症和非医源性辐射防护提供一种新的研究思路和手段。方法1．MTI’比色法检测不同剂量X射线对L02细胞的损伤和NADH对细 胞X射线损伤的影响。应用流式细胞仪检测NADH对X射线和 UVB紫外线诱导的细胞凋亡率的影响。nJNNEI。凋亡染色、透射 电镜和扫描电镜观察细胞凋亡及其超微结构改变。2．应用流式细胞仪检测NADH对辐射诱导的L,02细胞损伤后信号传 递分子，如p53，p21，p16，bax，bcl．2等蛋白表达和细胞周期和 调节蛋白的改变：粘附式细胞仪检测细胞内：ROS，pH，Ca2’水平变 化；免疫印迹检测PARP和Caspase 3活性；I玎一PCR检测1953， bax mRNA表达水平。3．分离健康人群外周血单个核细胞，采用FITC或PE直接标记的单 抗和PI染色，应用流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群的变化、 细胞内IL-2R表达和外周血淋巴细胞凋亡率。4．昆明小鼠随机分为5组，分别为正常对照组、C060．Y辐照组、辐照 前给NADH药物组、辐照后给NADH药物组和辐照后给GM— CSF药物组。采用C060 Y射线一次性全身照射，照射剂量为6．0Gy， 剂量率为50cGy／min。观察小鼠30d内外周血白细胞变化和小鼠存 活率；透射电镜观察辐射后24h胸腺和脾组织淋巴细胞超微结构变 化；计算小鼠辐照后第10d胸腺和脾平均重量和指数变化；应用 HE染色观察肝、脾和脑组织病理学改变：瑞氏染色观察小鼠辐射 后24h骨髓有核细胞数和分裂指数变化；DNA凝胶电泳检测辐照 后24h和48h骨髓细胞凋亡变化。第一军医大学博：t研究生学位论文结果(一)NADH可以降低不同剂量X射线和UVB紫外线照射对细胞的损 伤作用 1．不同剂量X射线抑制L02正常肝细胞生长 随辐射剂量的增加，辐射后的L02肝细胞存活率明显下降，其中 辐射后24h细胞生长抑制最明显。各时间点对照组与假照射组相 比，细胞生长均明显受抑制。2．NADH降低L02正常肝细胞X射线损伤 在不同辐射剂量下，辐射后加入NADI-I药物组较不加NADI-I药 物组细胞生长抑制明显减轻，说明NADH可以降低辐射对L02 细胞生长抑制。3．NADH抗辐射诱导的L,02肝细胞凋亡 (1)NADH能够降低X射线诱导的细胞凋亡百分率 辐射后6 h、12 h和24 h检测细胞凋亡率，NADH能够明显降低 辐射诱导的细胞凋亡。并随着NADt{剂量的增加，凋亡率逐渐下 降，以辐射后加入NADH培养24h细胞凋亡率下降较为明显。 (2)NADH抑制UVB紫外线诱导人正常肝细胞株L,02细胞凋亡 辐射后24h检测细胞凋亡率，辐射后加入NADI-{药物组细胞凋亡 率(11．82％±2．68％)明显低于单纯照射组(28．76％±3．45％)。 (3)NADH对L02细胞U’VB照射后细胞周期调控