随着全球爆发甲型H1N1流感疫情并导致12000多人死亡，甲型流感病毒给人类公共卫生安全造成严重威胁并引起全球恐慌，对甲型流感病毒的快速诊断对于预防和控制全球流感大流行具有重要意义。甲型流感病毒血清型众多，抗原变异快，宿主范围广，各亚型间几乎没有交叉保护性，是进行诊断和防控的难点。目前，对于甲型流感病毒的诊断方法主要有病毒分离、血凝和血凝抑制、ELISA、RT-PCR等，但由于耗时冗长、灵敏度低、仅能检测特定亚型等缺点，很难满足当前流感疫情高发情况下快速、灵敏、特异和高通量的检测要求。因此快速、灵敏、高通量的甲型流感病毒流行亚型诊断方法的研制意义重大。　　 基因芯片技术是一种快速、灵敏、高通量的基因水平的诊断技术，可以用于多种病原微生物的检测，它的出现为同时对多种甲型流感病毒的快速检测和分型提供了可能。本实验利用基因芯片技术在H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2等五种甲型流感病毒流行亚型的检测和分型上做了初步的研究。同时建立了针对人群中流行的H1N1和H3N2两种甲型流感病毒亚型的实时荧光定量RT-PCR检测方法，并构建了H1N1亚型人流感病毒的反向遗传平台。研究的内容及结果主要包括：　　 1.甲型流感病毒流行亚型检测和分型基因芯片的研制及应用：根据NCBI中Influenza Virus Resource数据库，对大量已发表的H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2等五种亚型甲型流感病毒的HA和NA基因序列进行比对，确定每种亚型HA和NA基因的保守序列。根据这些保守序列用Array Designer4软件设计了79条长度在19-27bp的特异性探针和1条质控探针，通过用11株流感病毒分离株对79条探针进行筛选，最终得到46条各亚型特异性探针和1条质控探针，并将其点制成基因芯片。通过对基因芯片制备和工作条件的优化，确定了阵列布局、点样条件、点样浓度、预洗方法、杂交液组分、杂交温度，杂交时间、杂交后清洗方法、扫描参数及检测结果判定标准。在样品处理时利用通用引物RT-PCR扩增五种亚型流感病毒的HA和NA基因，用Klenow酶将Cy3荧光染料导入扩增产物并将大片段产物片段化。利用11株不同种属来源的流感病毒分离株对所建立的基因芯片方法特异性进行检测，结果所有毒株都在其亚型所对应的芯片特定区域出现阳性荧光信号，且信号较强，在其它亚型区域未出现非特异性荧光信号。说明芯片能很好的对以上五种亚型甲型流感病毒进行检测和分型，有较好的特异性，并且对不同种属来源的毒株都具有检测能力。将A/Nanchang/14/1996，A/swine/Zhejiang/1/2004，A/Hong Kong/1180/99，A/chicken/China/1204/04，A/Chicken/Shanghai/F/98等五个病毒分离株的HA和NA基因片段进行体外转录，得到五种亚型的HA和NA基因RNA标准品，将梯度稀释后的RNA标准品用于芯片检测灵敏度试验，结果表明芯片对H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2五种亚型流感病毒的检测灵敏度分别约为1×105、1×105、1×104、1×104和1×105基因拷贝。将208份咽拭子和17份鼻拭子用所建立的基因芯片方法进行检测，结果表明芯片共检测到20份临床样本中存在甲型流感病毒，其中12份检测结果为H1N1亚型阳性，6份检测结果为H3N2亚型阳性，2份检测结果为N2阳性，其余样本检测结果为阴性。同时将阳性样本进行鸡胚病毒分离，结果表明7份为H1N1亚型阳性，3份为H3N2亚型阳性。以上结果显示所建立的基因芯片方法具有较高的灵敏度和准确性。　　 2.甲型流感病毒H1N1和H3N2亚型荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用：针对H1N1和H3N2两种亚型流感病毒的HA和NA基因保守序列分别设计1对特异性引物，使用SYBR Green I荧光染料进行荧光定量RT-PCR反应，根据扩增曲线和熔解曲线判定检测结果。利用11株不同种属来源的流感病毒分离株对该方法的特异性进行检测，用体外转录所得的HA和NA基因RNA标准品对该方法的灵敏度进行检测，用A/Nanchang/14/1996毒株的HA基因RNA标准品对该方法的重复性进行检测。结果表明每组引物仅能检测其所对应的亚型，对其他亚型无非特异性扩增，检测灵敏度达100个基因拷贝数，变异系数在0.04％以下，表明该方法具有良好的特异性和灵敏度，且反应体系稳定，重复性良好。将208份咽拭子和17份鼻拭子用所建立的荧光定量RT-PCR方法进行检测，结果表明共检测到23份阳性样本，其中14份检测结果为H1N1亚型，9份检测结果为H3N2亚型。同时将阳性样本进行鸡胚病毒分离，结果表明7份为H1N1亚型阳性，3份为H3N2亚型阳性。以上结果显示所建立的荧光定量RT-PCR方法具有较高的灵敏度和准确性。　　 3.为了进一步研究人源H1N1亚型流感病毒的致病机制及病毒的结构与功能，本研究选取一株背景清晰的人流感病毒分离株(A/Nanchang/14/1996)进行反向遗传平台的构建。成功将该毒株所有八个基因片段全长连入pHW2000载体，并通过共转染成功用八质粒拯救出该病毒。