论文部分内容阅读
泛素化途径广泛参与植物生长、发育和胁迫反应的调控。F-box蛋白作为E3泛素连接酶的一个亚基,参与了蛋白质泛素化降解途径。近年来研究发现,植物F-box蛋白在对环境胁迫的响应过程中发挥着重要的调节功能。本论文鉴定了拟南芥F-box(SKP1-Cullin/CDC53-F-box)超家族的一个成员At4g33160(在这里我们将其命名为Drought Induced F-box 1,DIF1)的功能。克隆了DIF1 的 CDS 全长序列,通过对 DIF1上游启动子顺式作用元件以及非生物胁迫处理下DIF1的表达的分析,研究了DIF1的时空表达模式和对非生物胁迫(盐、甘露醇、干旱和冷害)及ABA(abcisicacid)处理后的响应。RT-PCR分析表明,DIF1能够被盐、甘露醇、干旱和ABA所诱导,其表达还受到冷胁迫的抑制。组织特异性表达结果显示DIF1的表达呈现组成型,在拟南芥的根、茎、莲座叶、茎生叶、花及果荚中均有表达,在果荚中表达丰度相对较高。亚细胞定位的结果显示DIF1定位于细胞核。为了进一步研究DIF1参与植物调节对盐、甘露醇、干旱和ABA响应的可能功能,我们构建了35S::DIF 的过表达载体,侵染拟南芥,获得了 2个株系的纯合体,同时我们还筛选并鉴定了 2个DIF1 T-DNA插入功能缺失性突变体dif1-1和dif1-2株系。通过对35S::DIF1植株及dif1突变体植株进行甘露醇胁迫处理,发现35S::DIF1植株对甘露醇胁迫敏感,主要表现在主根长、子叶变绿和鲜重等生理指标上,而dif1突变体植株对甘露醇胁迫不敏感。四周苗龄的35S::DIF1植株及dif1突变体经盐梯度处理后,发现35S::DIF1植株对盐胁迫不敏感,主要反映在盐处理之后的成活率上,而dif1突变体对盐胁迫敏感,成活率较低。元素分析的结果显示,盐胁迫条件下,与野生型相比,35S::DIF1植株积累较少的钠,而dif1突变体植株钠的积累量较多。经过干旱处理后,35S::DIF1植株对干旱胁迫敏感,而dif1突变体植株则表现为更加耐干旱。ABA处理研究显示,35S::DIF1植株对0.1、0.2μMABA处理反应不敏感,反映在种子萌发、主根长、子叶变绿和鲜重上;相反,dif1突变体植株对ABA胁迫敏感。气孔运动实验显示,35S::DIF1植株对ABA诱导的气孔关闭不敏感,所以在干旱条件下易失水而死亡;币dif1突变体则呈现出相反的表型。进一步检测了35S::DIF1和dif1突变体植株中ABA响应相关基因ABI1、ABI2、PP2G4、ABF3和ABI5的表达。qRT-PCR结果显示,上述5个基因在35S.:DIF1植株中均发生下调,而在dif1突变体中呈现上调趋势。综合上述结果表明,DIF1参与了植物对环境胁迫的反应,并且与ABA有关。由此可知,DIF1参与调节盐、甘露醇和干旱的胁迫反应依赖于ABA的信号通路。DIF1作为E3泛素连接酶的一个亚基,参与了蛋白泛素化降解途径。为了找到其作用的下游靶标,我们构建了 pGBKT7-DIF1的诱饵载体,运用酵母双杂交的方法筛选了拟南芥cDNA文库,获得了 24个候选阳性克隆,他们分别是At3g56510、PGRL1A、MPK20、At3g22890、At5g17670、At4g21110、At1g20220、At1g77940、At5g54760、ASB1、ATS3、At1g07080、TPX2、GID1c、At2g26250、At1g76920、UBQ1O、At4g32530、At4g35000、At5g05010、At4g00895、At4g22670、NIT1、At3g44310。经过初步分析,其中定位于细胞核的5个基因(At3g56510、At1g20220、At2g42880、AtGID1c和At1g76920)为DIF1互作基因的可能性较大。同时,我们还构建了pGBKT7-LC 的诱饵载体(LCR是miR394的靶基因),也对拟南芥cDNA文库进行了筛选,经过进一步鉴定获得了 3个与LCR发生相互作用的蛋白,编码它们的基因分别是At4g29960,At5g64170和At2g18960。上述基因的鉴定为后续深入研究DIF1和LCR的靶基因及相关功能奠定了基础。