随着全球病毒性传染病的不断出现和流行,控制和预防这类传染病的快速传播取决于能否获得有效且安全的病毒疫苗。近年来,采用动物细胞培养技术生产病毒疫苗所凸显的安全性、经济性、时效性和有效性优势日益明显,对于流感疫苗而言,更是有望取代传统鸡胚生产方式而成为未来的主流。相较于有血清贴壁细胞培养,无血清悬浮培养在操作可行性、过程稳定性和经济性等方面有更大的发展空间。然而,在基于动物细胞培养技术的流感疫苗生产工艺开发过程中,悬浮细胞在高密度无血清培养条件下的病毒扩增效率相较于鸡胚生产工艺而言仍缺乏优势,对其生产获得的流感病毒免疫原性也认知甚少。因此,认识高密度工艺条件下培养环境和操作参数等对细胞生长、病毒扩增以及病毒蛋白质属性的影响,对于建立高产且优质的基于动物细胞高密度无血清悬浮培养的流感疫苗生产工艺显得尤为重要。本文首先考察摇瓶中培养基、病毒驯化、病毒感染相关参数以及生物反应器中相关关键操作参数对MDCK（Mardin-Darby canine kidney）悬浮细胞生长和流感病毒扩增的影响,并采用生物反应器评价MDCK细胞培养和病毒扩增的工艺表现,建立高效的基于MDCK细胞无血清悬浮培养的流感病毒疫苗稀释流加生产工艺。然后,尝试将灌注培养技术应用于流感病毒疫苗的生产,在摇瓶规模建立MDCK细胞的半连续灌注培养模型,并针对高密度培养条件下的“细胞密度效应”问题,优化相关工艺条件。通过生物反应器ATF（Alternating tangential flow）实验设计并优化细胞培养和病毒扩增工艺,建立一个高效自动化的采用ATF灌注培养的病毒生产工艺。最后,比较稀释流加培养和灌注培养的工艺表现,以及两个工艺所生产的流感病毒蛋白生物学属性,重点分析流感病毒蛋白的糖基化模式,为将来建立高效且优质的基于动物细胞培养的流感疫苗大规模生产工艺奠定科学基础。本文首先通过摇瓶实验优选了支持细胞高密度生长的Xeno-CDM1无血清培养基,且研究发现经过驯化后的病毒能显著加快病毒感染复制进程。在此基础上研究并优选了病毒感染复制的操作条件:MOI（Multiplicity of infection）为0.001,胰酶浓度为20-30 U/mL,并在病毒感染时采用1:1或1:2的稀释流加方式将细胞密度调整为6.0×106 cells/mL。在该工艺条件下摇瓶培养实验的病毒HA（Hemagglution assay）滴度和单细胞病毒产率分别可达3.60 log10（HAU/100μL）和12000 virions/cell以上。生物反应器实验结果发现了其搅拌转速和pH对细胞生长及病毒增殖有一定影响,采用80 rpm的搅拌转速以及产毒期控制7.20的pH较为适宜。在此基础上在生物反应器规模成功开发了基于MDCK细胞无血清悬浮培养的流感疫苗生产工艺,在该工艺中细胞可生长至1.0×107 cells/mL,单细胞病毒产率可达10000 virions/cell以上,病毒HA滴度可达3.60 log（HAU/100 μL）以上。经过下游纯化工艺后宿主细胞DNA和杂蛋白去除率及病毒回收率均达到行业标准。此外,确立了 21-24 hpi时间段为病毒培养液最佳收获点,可作为未来生产工艺的一个关键工艺属性。由于细胞密度和病毒扩增效率是决定基于动物细胞培养的流感病毒疫苗生产工艺病毒产量的两个关键因素,因此为了进一步提升病毒产量,本文尝试了将灌注培养技术应用于流感病毒疫苗的生产。首先在摇瓶规模建立了 MDCK细胞的半连续灌注培养模型,发现了当控制细胞比灌注速率为60 pL/cell/d时,可支持MDCK细胞生长超过4×107 cells/mL,流感病毒HA滴度达到4.20 log10（HAU/100μL）以上。另外,摇瓶模型实验还发现MOI和胰酶浓度是影响高密度MDCK细胞扩增流感病毒的重要因素,当MOI和胰酶浓度分别为0.001和20 U/mL时较为适宜。然后针对生物反应器ATF连续灌注培养实验中发现的“细胞密度效应”问题,进一步研究发现了产毒期pH控制和降温操作对提高流感病毒的扩增效率具有显著作用,同时也发现降温培养使更多流感病毒透过ATF膜流入收获液中。此外,为了确保灌注培养工艺的经济性和运行稳定性,研究还发现了灌注速率的控制至关重要。第一,控制比灌注速率为40 pL/cell/d的细胞比灌注速率能较好平衡病毒产率和培养基消耗。第二,研究发现了电容电极的电容率与活细胞密度之间具有良好的线性关系,因此引入电容电极用于在线监测灌注培养生长期的活细胞密度,以实现灌注速率的自动化精准控制。据此本文最终建立了可应用于流感病毒疫苗生产的经济高效且实现自动化控制的灌注培养工艺,其中MDCK细胞密度超过4×107 cells/mL,流感病毒HA滴度高达4.37 log10（HAU/100 μL）,单细胞病毒产率达到11000 virions/cell以上,有效克服了细胞密度效应。最后,本文比较分析了 MDCK细胞灌注培养和稀释流加培养生产流感病毒的工艺表现以及所生产病毒抗原HA蛋白的生物学属性。研究发现,优化后的MDCK细胞灌注培养工艺与稀释流加培养工艺相比,获得的单细胞病毒产率相同,病毒滴度因细胞密度的提高而相应提高了 5～8倍。虽然就MDCK细胞灌注培养工艺而言,以单位培养基消耗定义的病毒产率略低,但以培养装置体积定义的空时产率却远高于稀释流加培养工艺,突出了灌注培养工艺的产能优势,更有潜力应用于流感大流行爆发时的疫苗生产。另外,本文测试了不同的流感病毒株,其采用MDCK细胞灌注培养工艺后均能获得产量的有效提升,表明本文所建立的灌注培养工艺对其它型和亚型流感病毒具有一定的普适性。然后在对两种工艺生产的流感病毒HA抗原蛋白的研究证明MDCK细胞生产的病毒HA核酸序列未发生突变,与原有鸡胚病毒株一致。对HA蛋白糖基化的研究进一步发现8个潜在N-糖基化位点上均有糖基化修饰存在,且存在不均一性,糖型主要以复杂型糖型为主,且两种细胞培养工艺对HA蛋白糖基化修饰的影响不大。通过计算机模拟方法研究发现,抗原位点内部或附近的糖基化修饰可能会干扰抗体与HA蛋白主要表位的结合,但是这种干扰并不会影响HA蛋白受体结合位点与唾液酸的结合能力。不过糖基化模式可能会对先天性免疫和获得性免疫产生一定的影响,需要在未来的流感疫苗开发中予以重视。通过本文的研究,一方面成功地建立了经济、高效的基于悬浮MDCK细胞高密度无血清培养的流感病毒稀释流加生产工艺和灌注培养生产工艺,为其大规模的产业化生产奠定了技术基础。另一方面,对基于动物细胞培养技术生产的流感病毒包括糖基化在内的蛋白属性的研究,为我们进一步深入理解流感疫苗的免疫原性提供了科学基础。